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系统获得性抗性(Systematic acquired resistance，SAR)是植物抵御病原菌侵染的最有效手段，利用基因工程技术导入SAR信号发生过程中的关键基因后，植物的SAR基因表达量提高并且对病原菌侵染的反应速度加快，因此植物的抗病性得以增强，与传统的抗病基因工程技术相比它对病原菌没有专一性，许多学者称之为广谱抗病基因工程，该领域已成为目前抗病基因工程研究的热点和前沿。 NDR1和NPR1基因在植物的SAR发生中起着重要的作用，前者功能定位在ROS(reactive oxygen species)的激活和随后的水杨酸(SA)诱导合成之间，突变株病原菌诱导后SA合成能力降低，SAR发生减弱，目前还没有对该基因进行过量表达分析的报道；后者功能定位在SAR信号转导级联反应之中的SA积累和随后的SAR基因表达之间。该突变株在病原菌侵染时不产生病程相关蛋白(PRs)，表现为感病，而对照抗病；过量表达该基因的转基因拟南芥对多种病原菌的侵染产生抗性，PR1等PRs蛋白的表达量也提高，异源表达该基因的水稻对白叶枯病的抗性也提高。本研究利用RT-PCR方法从拟南芥中克隆了这两种基因，序列分析表明拟南芥Wassilewskija生态型的NDR1基因与Columbia生态型相比，共有7处碱基不同，引起编码氨基酸变化4处，而NPR1基因与报道的Wassilewskija生态型来源的NPR1基因完全相同。 我们构建了35S启动子驱动的NDR1和NPR1基因的植物组成型高效表达载体，利用农杆菌介导法转化烟草，PCR和Southern鉴定外源基因已经整合到植物基因组中。抗病性分析显示过量表达NDR1和NPR1基因的烟草对晚疫病和赤星病的抗性都有明显提高，说明这两个基因的在其它植物中异源表达后，都能提高植物对多种病原菌的抗性。 本论文提出了利用这两个基因来培育抗黄萎病棉花的设想，一方面为解决这个“世纪性”难题积累新的资料，另一方面也为其它作物的抗病基因工程提供新的经验。利用35S启动子驱动的NDR1和NPR1基因的植物组成型表达载体分别对陆地棉品种石远321进行花粉管通道法转化。同时，还探讨了这两个基因在棉花中的共转化实验，希望它们的“协同增效”能进一步提高棉花的抗病性。对其中2001年夏天在南京注射所获得的5，000粒种子在三亚进行100μg／ml卡那霉素筛选，初步鉴定分别获得转NBR1和NPR1基因株系26和24棵，PCR进一步鉴定其中分别有12和7棵为转基因阳性，转基因频率分别为0.50％和0.27％，目前利用营养钵蘸根法对其二代进行抗枯、黄萎病鉴定，结果显示有转基因植株对枯、黄萎病的抗性都明显增强，进一步的鉴定正在进行中。2002年初海南注射分别获得转NDR1和NPR1基因以及共转化种子22，000、10，500和12，500粒种子，2002年夏在中国农科院植保所黄萎菌病圃筛选抗黄萎病单株，并利用100μg／ml卡那霉素初步筛选出了一批抗性植株，每种转基因株系随机挑选5株进行PCR鉴定，结 训记抚贾要霜压国工霍研宠和防Z反应租照压因的不肚 果显示为阳性。进一步的抗黄萎病鉴定和筛选以及分子分析正在进行中。 同时，本文还探讨了病原菌诱导型启动于在广谱抗病基因工程应用的可能性。根据 烟草的 Pr la启动子已知序列设计引物，PCR扩增启动子序列后，构建病原菌诱导型 NPi 基因植物表达载体，并对棉花进行转化，获得种子11，5皿粒，利用同上的筛选方法， 获得了一致的结果，目前抗黄萎病鉴定、分子检测以及生物学分析正在进行中。巴 最后，鉴于抗生素标记在转基因植物的应用引起了许多“安全性”争论的事实，还 构建了无筛选标记的表达载体对抗虫棉进行转化，这样在生产上可以直接获得抗虫棉抗 黄萎病棉花新材料，也为其它作物抗病基因工程积累经验。 本研究还提出了一种较为有效的提取高质量棉花总RNA的方法，与原来一些棉花 RNA纯化方法相比，该方法所用都为常规试剂，易于重复，质量高。并且利用获得的 总 KNA构建了黄萎菌激发子诱导的 CDNA文库，滴度测定为 IX107pf卜小g，插入片段 大小在 5 00－2 000 hp范围内。 鉴于 NPR基因研究的重要性，本研究还利用简并引物 PCR技术从海岛棉和陆地棉 的基因组中都分离到了 NPRI基因的同源片段，大小都为 208 hp，与拟南芥NPRI基因 的相应部分的同源性分别为66％和65％，它们之间的同源性为87％，目前该基因的全 长正在分离鉴定中。 多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白oGIPS）在植物的防御反应中起着重要的作用，通过分析 已知 20余种 pgip基因序列的保守区，设计简并引物，PCR扩增海岛棉（Go聊ium barbadense）7124 cDNA文库，得到一条长 561 hp的片段，序列测定后分析确认为pgo 基因的一部分。根据此序列和棉花病原菌诱导的CDNA文库载体中已知部分设计RACE 引物，扩增后，5’和 3’KACE分别得到 666hp和 906 hp的片段。序列分析表明它具有完 整的编码框，产物为 330 aa的?