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为了探索对于猪不同时期卵母细胞毒性最低,冷冻效果最佳的冷冻保护液配方,寻找最适合猪不同时期卵母细胞的冷冻方法,分析猪不同时期卵母细胞冻后发育能力降低的影响因素,从而为成功冷冻猪卵母细胞能应用于生产实际提供理论支持。因此本研究以GV期和MⅡ期卵母细胞作为试验材料,应用玻璃化冷冻方法,就目前应用最多的七种冷冻保护液配方进行筛选,比较三种不同冷冻载体冷冻卵母细胞的效果差异,并通过透射电镜方法观察卵母细胞冷冻前后的超微结构变化,采用彗星电泳方法分析冷冻对卵母细胞造成的DNA损伤情况。结果发现：1.七组冷冻保护液对MⅡ期卵母细胞有低毒性作用,各组分裂率、囊胚率、囊胚细胞数均低于对照组,5组的分裂率与对照组差异显著(P<0.05),1组的囊胚率与对照组差异显著(P<0.05)。其余各组间分裂率和囊胚率无统计学差异。综合各组指标选取3组、6组和7组为对猪MⅡ期卵母细胞的发育能力损伤最小的前三组冷冻保护液,应用GMP管对其冷冻保护效果进行比较,发现乙二醇单独使用或者乙二醇和二甲基亚砜混合使用都是适合MⅡ期卵母细胞玻璃化冷冻的保护剂配方。综合考虑,选取HM+7.5%(DMSO+EG),HM+17％(DMSO+EG)+0.4M Su作为冷冻保护液来比较三种不同冷冻载体冷冻卵母细胞的效果差异,发现OPS法形态正常率显著高于GMP法和半麦管法(P<0.05),分裂率显著低于半麦管法(P<0.05),三种方法囊胚率差异不显著,但半麦管法获得5枚囊胚且囊胚细胞数量最高,OPS法获得1枚囊胚,而GMP法并未获得囊胚。且半麦管冻融后MⅡ期卵母细胞的分裂率高达53.67%,显著高于OPS法的29.33%及GMP法的35.00%。因此半麦管法更适合MⅡ期猪卵母细胞的玻璃化冷冻。2.应用七种不同冷冻保护液处理GV期卵母细胞发现,各组卵母细胞极体率与对照组差异不显著,说明冷冻保护液对GV期卵母细胞的成熟影响较低。对成熟后卵母细胞孤雌激活发现,1、7组的分裂率、囊胚率和囊胚细胞数与对照组均差异显著(P<0.05),其他各组间差异不显著。综合各项指标选取3组、5组、6组为对GV期卵母细胞处理损伤小的前三组冷冻保护液,应用GMP法冷冻GV期卵母细胞发现,2组获得6枚囊胚,且第2组囊胚平均细胞数高于第1、3组。综合考虑,选取第2组HM+7.5%(DMSO+EG)、HM+15%(DMSO+EG)+0.5M Su作为冷冻保护液来比较三种不同冷冻载体冷冻卵母细胞的效果差异,发现半麦管法冷冻GV期卵母细胞存活率显著高于OPS法和GMP法(P<0.05),但三种方法获得的极体率、分裂率和囊胚率差异均不显著。因此半麦管法更适合GV期猪卵母细胞的玻璃化冷冻。3.透射电镜下观察卵母细胞发现,GV期卵母细胞与透明带连接紧密,微绒毛伸入透明带中,皮质区分布大量的线粒体。皮质区可见大量成簇的长管状内质网,散在的高尔基体。细胞质内可见许多脂肪滴,脂滴(LD)分为两种,一种为灰色脂滴(GLD),一种为深色脂滴(DLD),通常与线粒体相伴出现,且脂肪滴的周围由内质网不连续包裹着。MⅡ期卵母细胞排出第一极体,质膜下分布大量的皮质颗粒。微绒毛(Mv)缩短成矮柱状,线粒体(Mi)常聚集存在,线粒体嵴清晰,卵周隙出现。细胞质包含灰色脂滴和深色脂滴两种,无高尔基体。4.冻后GV期卵母细胞透明带、细胞膜损伤,微绒毛(Mv)消失,线粒体肿胀、嵴不明显。皮质区以深色脂滴为主,包围脂滴的内质网(ER)不完整,胞质内溶解为絮状,未见高尔基体。冻后MⅡ期卵母细胞透明带(ZP)损伤、微绒毛、细胞膜损伤甚至消失、极少量皮质颗粒分布于皮质区。脂滴部分溶解,相互连接,脂滴周围伴随大量肿胀呈圆形的线粒体,嵴不明显。玻璃化冷冻会造成GV期、MⅡ期卵母细胞不同程度的严重损伤。5.采用彗星电泳方法检测冷冻对卵母细胞DNA的损伤发现,冷冻保护液对GV期、MⅡ期卵母细胞的毒性较低,DNA损伤与对照组差异不显著,但玻璃化冷冻对GV期、MⅡ期卵母细胞的DNA损伤与对照组和冷冻保护液处理组相比差异显著(P<0.05)。玻璃化冷冻会对不同时期卵母细胞的DNA造成严重损伤。