狂犬病病毒(rabies virus,RABV)是弹状病毒科狂犬病毒属成员,是当今世界人和动物狂犬病的致病原,具有高度嗜神经性和致死性。在RABV感染病例的脑组织中常出现神经细胞变性及细胞骨架发生改变,但目前该病毒的致病机制仍远不明了。本研究利用RABV体外感染模型,研究了病毒基质蛋白(M)与线粒体凋亡通路之间的关系、M蛋白介导子代病毒粒子出芽过程中与细胞微丝骨架之间的关系以及RABV感染对微管骨架的影响,旨在为深入研究RABV的致病机制和寻找潜在药物治疗靶点奠定基础。细胞凋亡作为机体重要的防御机制之一,在机体清除体内病毒的过程中发挥重要作用。在病毒与宿主相互抗争的过程中,病毒进化出一系列策略调控宿主细胞凋亡。一些病毒在感染早期能够抑制凋亡,进而促进病毒的感染和复制;而一些病毒在感染晚期利用凋亡,促进病毒扩散和传播。本研究以狂犬病病毒高致病力毒株CVS感染鼠成神经瘤细胞N2a为模型,解析了 RABV感染诱导细胞凋亡的通路。Caspase酶活性检测结合共聚焦实验结果表明,RABV感染激活caspase-9并导致线粒体内的促凋亡蛋白cyto c和AIF分别移位进入细胞质和细胞核。由此说明RABV感染激活依赖和非依赖caspase的线粒体凋亡通路,诱导细胞凋亡。构建病毒蛋白的真核表达质粒转染细胞后发现,单独表达病毒M蛋白导致线粒膜电势下降以及caspase-9和-3的酶活性显著升高,与RABV感染的结果相似。共聚焦实验发现,在RABV感染的细胞中或单独表达M蛋白的细胞中,部分M蛋白与线粒体呈共定位关系。构建M蛋白的截短突变体并结合共聚焦和TUNEL实验发现,M蛋白的67aa～79aa所形成的的α-螺旋结构负责M蛋白的线粒体定位和诱导细胞凋亡,由此表明病毒M蛋白直接作用于线粒体,消耗线粒体膜电势,激活线粒体凋亡通路。M蛋白除了作用于线粒体外,本研究利用共聚焦显微镜还观察了M蛋白在细胞膜处介导子代病毒粒子出芽的动态过程。M蛋白在感染4h分布在细胞膜内侧,在感染8 h于细胞膜处出现明显的聚集,在感染12 h于细胞膜处形成囊泡突向细胞外,而在16 h囊泡脱离细胞膜,释放到胞外,说明M蛋白已完成介导子代病毒粒子的出芽和释放。进一步对RABV感染的细胞图像进行细节放大后可见M蛋白在细胞膜处形成的出芽囊泡与微丝呈现明显共定位。药物处理破坏微丝骨架导致M蛋白形成的出芽囊泡在细胞膜内侧大量滞留且细胞培养上清中的病毒滴度显著下降,由此证实M蛋白在细胞膜处介导子代病毒粒子的出芽依赖于微丝骨架。此外,我们通过共聚焦实验还发现RABV感染诱导微管解聚且病毒M蛋白形成丝状结构。有趣的是,凡是在M蛋白形成丝状结构的细胞中,微管骨架都发生解聚。药物处理微管骨架发现,解聚微管促进病毒的转录和复制,而稳定微管却抑制病毒的转录和复制并抑制M蛋白丝状结构的形成。WB实验发现RABV感染上调去乙酰化酶HDAC6的表达水平,导致微管乙酰化修饰水平下调。药物抑制HDAC6的去乙酰化酶活性显著抑制病毒的转录和复制。此外,单独表达病毒M蛋白显著诱导微管解聚。这些结果说明,RABV感染诱导微管解聚,促进病毒的转录和复制;病毒M蛋白丝状结构的形成与诱导微管解聚具有相关性。上述结果表明,病毒M蛋白具有多功能性,一方面作用于线粒体,激活线粒体凋亡通路,诱导细胞凋亡,另一方面在细胞膜处利用宿主的微丝骨架促进子代病毒粒子的出芽。此外,病毒M蛋白与诱导微管解聚密切相关。