玻璃体条件培养液对人视网膜色素上皮细胞生长活性影响及其机制的实验性研究目的增生性玻璃体视网膜病变(PVR)的基本病理过程是多种细胞尤其是视网膜色素上皮细胞(RPE)的移行、增生，在视网膜前后及玻璃体腔内形成增生膜，最终增生膜的收缩导致牵拉性视网膜脱离，属于增生性疾病。但对于RPE细胞病理性增生的具体机制尚未明确，现已有大量关于生长因子、细胞因子通过不同的信号途径作用于RPE细胞导致其病理性增生的报道。视网膜神经层损伤后造成的RPE细胞与玻璃体的接触是PVR发生的高危因素，但玻璃体作用的具体机制仍未明确。研究发现在PVR这一病理过程中玻璃体液内多种细胞因子的含量发生了改变。PVR患者的玻璃体液能促进增生膜中胶原的合成以及增生膜的收缩，从PVR的不同环节参与疾病的演进过程。这些结果提示了玻璃体作为刺激因子，在RPE细胞的生长状态及PVR的发生中起着关键性作用。我们用玻璃体液作用于体外培养的HRPE细胞来观察RPE细胞生长状态的改变；p-ERK表达、分布的改变及c-fos原癌基因的转录水平在此期间的变化；并探讨这些改变的可能机制，为进一步明确PVR的发病原因及临床治疗奠定理论基础。方法第一部分玻璃体条件培养液对HRPE细胞生长活性及细胞周期的影响的检测1、HRPE细胞的培养及鉴定在无菌状态下，用胰酶消化法获取视网膜色素上皮细胞进行原代及传代培养。抗角蛋白抗体免疫组织化学染色进行鉴定。2、玻璃体条件培养液的制备将玻璃体完全去除视网膜及色素组织后收集于15mL无菌离心管中。0℃，10000r离心30min，0.22μm微孔滤膜过滤，深低温冰箱—78℃备用保存。将不同体积的玻璃体加入含1％小牛血清的DMEM培养液中制成不同浓度(10％、25％、50％及100％)的玻璃体条件培养液(VCM)。3、VCM作用后HRPE细胞形态学、生长活性及细胞周期的检测将VCM作用于原代及传代HRPE细胞，倒置显微镜下观察其生长状态的改变并照相。生长活性及细胞周期的变化分别用MTT及流式细胞术观察。第二部分玻璃体条件培养液对HRPE细胞内p-ERK表达水平及分布影响的检测1、免疫荧光化学检查收集培养的第3代HRPE细胞后均匀接种于24培养板内，对照组用平衡盐溶液代替实验组玻璃体液的体积，实验组加入25％VCM。于不同时间点中止作用，按常规步骤进行免疫荧光染色，倒置荧光显微镜观察目的蛋白的分布并照相。2、Western blot分别检测不同浓度VCM作用不同时间后HRPE细胞内p-ERK的表达水平将第3代HRPE细胞接种于75mL培养瓶中。实验组加入25％VCM作用不同时间或不同浓度VCM作用10min，对照组加入平衡盐溶液来替代玻璃体的体积，其余条件相同。收集实验组和对照组各约2×10~6个细胞，Western blot检测HRPE细胞内p-ERK的表达水平。第三部分玻璃体条件培养液对HRPE细胞内c-fos蛋白表达水平影响的检测1、免疫荧光化学检测收集第3代HRPE细胞后均匀接种于24培养板内，对照组用平衡盐溶液代替实验组玻璃体液的体积，实验组加入25％的VCM作用不同时间后进行免疫荧光细胞化学检查，倒置荧光显微镜观察并照相。2、RT-PCR检测不同浓度VCM作用不同时间后HRPE细胞内c-fos基因mRNA表达水平将第3代HRPE细胞接种于75mL培养瓶中。实验组加入25％VCM作用不同时间或加入不同浓度VCM作用15min，对照组加入平衡盐溶液来替代玻璃体的体积。RT-PCR法检测c-fos基因mRNA的表达水平，RT-PCR产物经电泳扫胶成像记录。第四部分玻璃体体条件培养液作用下HRPE细胞内c-fos蛋白表达的信号传导机制的研究分别用钙离子，PKC，ERK信号传导系统特异的阻遏剂阻断其各自的信号传导后，用RT-PCR方法检测25％VCM作用15min后，HRPE细胞的c-fos mRNA转录水平的改变。结果一、玻璃体条件培养液对HRPE细胞生长活性及细胞周期影响的检测结果：1、HRPE细胞的培养及鉴定结果经消化取材的HRPE细胞原代为圆形、胞体透亮、含较多黑色素颗粒，镜下看不清胞核。取材12h后细胞开始贴壁，伸出伪足，变成扁平不规则多角形，可见清晰透明的圆形细胞核及双核细胞，胞浆内含丰富黑色素颗粒，迅速分裂繁殖，约5-7天后细胞基本融合成单层。荧光显微镜下观察HRPE细胞提示角蛋白表达呈强阳性，荧光物质遍及胞质。2、VCM作用后HRPE细胞生长状态的观察结果对照组的HRPE原代细胞呈扁平不规则多角形，可见清晰透明的圆形单核或双核，细胞内含有较多的色素颗粒，传至3—4代后细胞内无明显的色素颗粒，细胞呈梭形或多角形生长。加入10％、25％及50％的VCM后，HRPE细胞生长旺盛，分裂象明显，有的细胞呈三核甚至多核，类似病理性核分裂，并且细胞在第2代就已经脱色素生长，呈分裂过度的老化状态，更快具有纤维细胞的表型。3、VCM作用后HRPE细胞生长活性的检测结果实验组的HRPE细胞较对照组相比生长明显旺盛，统计学分析均分别有显著性差异，这种差异在加入VCM培养后3d出现，并持续到实验观察结束。25％VCM刺激HRPE细胞发生增生的作用最强。100％VCM组的细胞细胞数递减逐渐死亡。4、VCM作用后HRPE细胞周期的检测结果实验组HRPE细胞进入S期的比例明显增多，同时伴随着G1期比例的下降及G2期比例的升高。在25％及50％的VCM组，有微量异倍体的出现，与对照组、10％VCM组及100％VCM组均为二倍体的细胞生长状态明显不同。25％VCM组使HRPE细胞发生异倍体的能力最强。二、玻璃体条件培养液对HRPE细胞内p-ERK表达水平及分布影响的检测结果1、免疫荧光化学检查结果25％VCM刺激了p-ERK由胞浆到胞核的转位。在对照组，p-ERK主要分布于胞浆中，且着色很弱，胞核未被染色。在加入25％VCM后，先是细胞浆着色变强，后阳性荧光转入细胞核，使细胞核也被荧光着色，在持续一定时间后这种转位消失，整个细胞又回到了静息状态。2、不同浓度VCM作用不同时间后细胞内P-ERK表达水平变化的Westem blot检测结果VCM作用于HRPE细胞后P-ERK水平随时间变化而波动：在加入25％VCM后5min就能检测到p-ERK的表达，10min后p-ERK的磷酸化水平即达高峰，在持续约2小时后p-ERK的磷酸化水平缓慢下降，而后回到基线水平。25％的VCM刺激ERK发生磷酸化的能力最强，100％的VCM不能使HRPE细胞的ERK发生磷酸化。三、玻璃体条件培养液对HRPE细胞内c-fos蛋白表达水平影响的检测结果1、免疫荧光化学检测结果免疫荧光化学显示25％VCM刺激了HRPE细胞内FOS蛋白的表达。对照组FOS蛋白基本不表达，细胞着色很弱，胞核未被染色。在加入含25％玻璃体的VCM后10min，部分细胞核出现荧光着色，加入VCM 20min后，几乎全部的细胞核被荧光着色，VCM作用后60min细胞基本回到静息状态，部分细胞核呈弱荧光。2、不同浓度VCM作用不同时间后HRPE细胞内c-fos基因mRNA表达水平的RT-PCR检测结果在加入VCM后5min就能检测到c-fos基因的mRNA转录，15分钟后c-fos基因的mRNA转录水平即达高峰，在持续约1h后回到基线水平。25％的VCM刺激c-fos基因转录的能力最强。四、VCM作用后HRPE细胞内c-fos蛋白表达的信号调控研究结果在VCM作用后HRPE细胞c-fos蛋白表达的信号调控中：钙与之无明显关系，但是PKC与ERK参与了c-fos mRNA的转录，且ERK的激活并非PKC依赖的。结论1、HRPE细胞在VCM作用下发生了细胞形态、生长状态及细胞周期的改变。2、HRPE细胞的p-ERK在VCM作用后发生了活化，发生了由浆到核的转位，并且它的活化水平存在时间与浓度依赖性。3、VCM使HRPE细胞的c-fos原癌基因转录水平发生了改变，其转录水平与时间及VCM浓度存在关系。4、VCM使HRPE细胞的c-fos原癌基因转录与钙离子信号无直接关系。5、PKC与MAPK信号途径参与了VCM诱导的HRPE细胞内c-fos原癌基因的转录。6、VCM诱导的MAPK活化所致的HRPE细胞内c-fos原癌基因转录不是PKC依赖的。