论文部分内容阅读
近年来,结直肠癌已跃居全球第三高发的恶性肿瘤。尽管不断更新的治疗方法使结直肠肿瘤患者的预后水平有所提高,但其中位生存期也仅约为18至22个月。因此,深入揭示结直肠癌发生发展的分子机制至关重要。结直肠癌是一种实体瘤。随着瘤体的不断增大,肿瘤中心部位组织常常处于缺乏血供的缺氧状态。肿瘤组织为了适应缺氧的微环境,会通过改变基因表达谱来调整其生物学行为。缺氧性肿瘤微环境能够通过诱导上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）、激活细胞自噬、促进炎细胞浸润等过程,促进肿瘤的发生和进展。沉默信息调节因子1（Silencing information regulator 1,SIRT1）是一种NAD+依赖的去乙酰化酶,通过催化组蛋白与非组蛋白发生去乙酰化调控多种信号途径,在细胞增殖、分化、凋亡、衰老及应激等过程中发挥重要作用。SIRT1在肿瘤的发生和进展过程中也同样起到重要作用,然而其到底是作为促癌因子抑或是抑癌因子而发挥作用,至今仍存在许多争议。大量研究表明,SIRT1能够对自噬的上游分子、起始复合物、自噬相关蛋白（Autophagy-related proteins,ATGs）等发挥去乙酰化作用,参与细胞自噬过程的调控。此外,SIRT1还能够通过与E-cadherin、vimentin、c-Myc、NF-κB（Nuclear factor-κB）、TGF-β（Transforming growth factor-β）等发生相互作用,对肿瘤的侵袭和迁移过程产生影响。在缺氧组织中,SIRT1受到HIF-1α（Hypoxia-inducible factor-1α）、Sp1和NF-κB等转录因子的调控,其表达水平的升高在心肌、肝和脑组织的缺血再灌注过程中发挥重要的保护作用;在肿瘤组织中,缺氧性微环境同样能够通过改变SIRT1的表达水平,影响肿瘤细胞的生物学行为。因此,本研究拟探讨缺氧条件下结直肠癌细胞中SIRT1表达水平的改变及其对细胞侵袭迁移、自噬的影响和相关分子机制。为了探究SIRT1在结直肠癌缺氧性微环境中表达水平的改变,我们以结直肠癌细胞系HCT116和SW480为研究对象,利用Western blot和real-time PCR对缺氧（1%O2）条件培养的肿瘤细胞进行了SIRT1表达水平检测,结果发现SIRT1 mRNA和蛋白表达水平随着缺氧时间的延长而降低,且在氯化钴模拟的化学性缺氧模型中也得到了相似的结果,表明缺氧能够抑制SIRT1的表达。通过对结直肠癌患者临床标本进行分析,发现与正常结直肠和癌旁组织相比,SIRT1在结直肠癌中的表达显著降低。为了明确缺氧影响SIRT1表达的具体机制,我们构建了含有不同长度SIRT1启动子序列截短体（自上游-1000 bp开始逐步截短）的双荧光素酶报告基因质粒;报告基因实验表明,缺氧影响SIRT1表达的核心转录调控区域位于其上游-100bp序列;利用生物信息学的方法,我们初步确定可能参与该调控过程的两个转录因子:EGR1（Early growth reponse 1）和USF2（Upstream stimulatory factor 2）,并利用已知转录因子Sp1作为阳性对照。研究结果表明,EGR1不仅能够调控SIRT1的转录水平,而且其转录激活作用超过Sp1,但未发现USF2对SIRT1具有转录调控作用;结合Western blot和染色质免疫共沉淀检测,我们发现EGR1在缺氧条件下表达降低,且与SIRT1上游-100 bp序列的结合明显减少;最后,针对该区域启动子进行点突变,我们发现EGR1结合于SIRT1上游-80-72 bp和-21-13 bp富含GC的模体（motif）上。由此,我们证实在缺氧条件下,EGR1调控SIRT1转录过程、影响SIRT1表达。为明确缺氧条件下SIRT1表达水平的改变是否对结直肠癌细胞生物学行为产生影响,我们分别构建了SIRT1敲减和过表达的稳定转染细胞株（HCT116 sh-SIRT1、SW480 Lenti-SIRT1）。利用Transwell方法,发现缺氧能够促进结直肠癌细胞的侵袭和迁移,SIRT1敲减细胞和SIRT1抑制剂（EX527）处理细胞的侵袭和迁移能力明显增强,而SIRT1过表达细胞和SIRT1激动剂（SRT1720）处理细胞的侵袭和迁移能力显著受到抑制。利用Western blot和real-time PCR对肿瘤细胞NF-κB及其下游分子进行检测,结果显示在缺氧条件下,NF-κB p65亚基310位赖氨酸乙酰化程度增加、MMP-2和MMP-9表达水平增加;低表达SIRT1的HCT116细胞NF-κB的乙酰化水平、MMP-2和MMP-9的表达水平较亲本细胞明显升高,提示低表达的SIRT1可能通过激活NF-κB通路,促进MMP-2和MMP-9的表达,进而影响结直肠癌细胞的侵袭和迁移。此外,我们对缺氧条件下肿瘤细胞自噬流的改变也进行了初步探究。Western blot和透射电镜结果表明,缺氧能够使自噬底物p62明显减少、LC3-I/II转换增强;细胞内自噬溶酶体的形成增多,细胞器形态出现异常改变。与亲本细胞相比,过表达SIRT1的细胞p62表达水平增加、LC3-I/II转换受到抑制、细胞内自噬溶酶体数量减少。为了进一步观测细胞内自噬流的情况,我们采用GFP-mRFP-LC3荧光双标腺病毒感染细胞,结果显示SIRT1过表达细胞自噬体与溶酶体融合受到抑制,自噬流被阻断。以上结果提示SIRT1参与缺氧状态下结直肠癌细胞自噬的调控,但具体机制如何,有待于我们进一步研究。综上所述,我们发现SIRT1能够影响缺氧条件下结直肠癌的进展,首次阐明EGR1参与缺氧条件下SIRT1转录抑制过程的调控,提出缺氧通过EGR1-SIRT1-NF-κB途径调控结直肠癌的侵袭和迁移,且SIRT1介导了缺氧条件下结直肠癌细胞自噬过程的调控。该研究丰富了SIRT1在结直肠癌发生和进展中的作用,为结直肠癌的临床治疗提供了可能的靶点。