【摘 要】
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中国是水产大国,水产品产量约占全球总产量的1/3以上,同时也是全球最大的海鲜消费市场,FAO预测2020年中国人均水产品消耗量高达36公斤。然而近年来水产品从养殖到销售的各个环节易受环境致病微生物污染,导致公共健康风险渐增。当前,水产品病原菌检测方法和标准存在检测周期长、操作繁琐等缺陷,难以满足当今食品安全快速检测的需求。因此,快速准确的检测技术有利于开展病原学研究,监督食品安全问题,保障居民的健
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中国是水产大国,水产品产量约占全球总产量的1/3以上,同时也是全球最大的海鲜消费市场,FAO预测2020年中国人均水产品消耗量高达36公斤。然而近年来水产品从养殖到销售的各个环节易受环境致病微生物污染,导致公共健康风险渐增。当前,水产品病原菌检测方法和标准存在检测周期长、操作繁琐等缺陷,难以满足当今食品安全快速检测的需求。因此,快速准确的检测技术有利于开展病原学研究,监督食品安全问题,保障居民的健康和国家的权益。本研究针对五种常见且危害较大的水产食品病原菌:嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila,AH）、沙门氏菌（Salmonella,Salmon）、致病性大肠杆菌O157:H7（Escherichia coli O157:H7,O157:H7）、副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus,VP）及单核增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes,LM）建立real-time RPA快速检测技术,可用于临床样品的快速检测,具有操作简便、灵敏度高的优点,为水产食品常见病原菌的快速检测提供了有效的技术手段。本研究包括以下内容:1.水产品常见病原菌real-time RPA检测方法的建立:确定五种水产食品病原菌的保守序列,分别针对嗜水气单胞菌hly基因（accession number:CP006870）、沙门氏菌invA基因（accession number:U43238）、致病性大肠杆菌O157 Z0372基因（accession number:AE005174）、副溶血性弧菌tlh基因（MH047288.1）和单核增生李斯特氏菌hlyA基因（accession number:HE999704）,设计探针和多对引物,组合筛选并优化反应条件。五种细菌单重real-time RPA最佳反应温度39℃、反应时间30 min、探针和引物浓度10 u M。在优化条件下,五种细菌单重real-time RPA方法对致病性大肠杆菌O157:H7最小检出量为10 copies/μL,其余各菌最小检出量均为100 copies/μL,敏感性均高于常规PCR方法10倍以上;五种细菌单重real-time RPA方法只对阳性模板有扩增信号,特异性强,与其他病原菌无交叉反应;五种细菌单重real-time RPA方法组内和组间变异系数均小于10%,重复性良好。2.real-time RPA技术检测临床样品和模拟样品的效果评价:我们采用传统细菌分离鉴定、real-time RPA和PCR对61份临床样品进行了检测。单核增生李斯特氏菌、致病性大肠杆菌O157、沙门氏菌、副溶血性弧菌real-time RPA和PCR两种方法无阳性检出;针对嗜水气单胞菌的real-time RPA检测方法相对传统检测方法样品检测灵敏度是73.7%（14/19）,特异性为100%（42/42）;PCR检测方法相对传统检测方法,样品检测灵敏度是57.89%（11/19）,特异性为97.61%（41/42）。结果表明,嗜水气单胞菌real-time RPA的检测灵敏度和特异性均高于PCR。AH、LM、VP、Salmon、O157:H7模拟污染样品检出限分别为:4CFU/25g;42 CFU/25g;20 CFU/25g;5 CFU/25g;15 CFU/25g,即real-time RPA方法的检出限比PCR方法灵敏10-100倍。本研究针对水产食品中危害较大的常见五种病原菌建立了real-time RPA检测方法,与传统方法及PCR检测方法相比,该方法具有反应时间短、无需昂贵设备,降低核酸样品中蛋白质等相关抑制剂影响等优点,适用于现场快速检测病原菌。临床样品和模拟样品的平行检测效果评价显示,针对五种病原菌建立的单重real-time RPA检测方法,检出效率高,为水产食品常见病原菌的快速检测提供了有效的技术手段。适合基层、养殖或者口岸水产品病原菌快速检测,为食品安全提供重要的技术支撑。
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