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氯丙醇酯是甘油酯结构中羟基或者酯键被氯取代的化合物,具有潜在的生殖毒性、肾毒性和免疫毒性,在精炼植物油、烘焙和煎炸等食品中都能被检测到,是食品热加工过程中产生的污染物。目前3-氯丙醇(3-MCPD)酯相关的研究较多,其同分异构体2-氯丙醇(2-MCPD)酯并未得到足够重视。究其原因,一方面2-氯丙醇酯相关的毒理学数据缺乏;另一方面2-氯丙醇酯合成过程中产生多种杂质,导致难以制备高纯度标准品。本论文旨在设计一条以丙二酸二乙酯为原料,在温和条件下合成游离的2-MCPD路线,然后再通过酯化反应得到六种不同结构的2-氯丙醇酯,并经过质谱、核磁共振波谱、红外光谱和圆二色谱等技术表征其结构;以合成的2-MCPD酯为分析标准品,构建和优化UPCC-q TOF检测2-氯丙醇单酯的方法,并以此为基础,用甘油酯模式反应证实棕榈油精炼条件下有2-氯丙醇单酯产生;采用最大限量法测定2-氯丙醇棕榈酸单酯(P-2-MCPD)和2-氯丙醇棕榈酸双酯(PP-2-MCPD)对Swiss小鼠的经口急性毒性,结果表明两种氯丙醇棕榈酸酯LD50(半数致死量)均大于5000 mg/kg body weight(BW),同时发现实验组血清中仅有睾酮显著降低;根据急性毒性实验结果,选用与睾酮合成相关的小鼠睾丸间质细胞系TM3为体外研究模型,基于细胞存活率研究2-氯丙醇酯对TM3的影响。进一步通过蛋白印迹法(Western blotting)分析2-氯丙醇棕榈酸单双酯对睾酮合成及细胞凋亡和坏死通路中关键蛋白表达量的影响,包括类固醇激素急性调节蛋白(StAR)、B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2关联的X蛋白(Bax)、切割的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Cleaved caspase 3)、混合谱系激酶域样蛋白(MLKL)和受体相互作用蛋白(RIP xp)等。主要结果如下所述:1.以丙二酸二乙酯为起始原料,在酸催化条件下,经二氯海因氯化得到氯代丙二酸二乙酯;然后在低温甲醇溶液中用硼氢化钠将氯代丙二酸二乙酯还原成游离的2-MCPD;通过Steglich酯化反应,在4-二甲氨基吡啶(DMAP)和N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)催化下将脂肪酸和游离的2-氯丙醇酯化,通过调控脂肪酸比例来控制单酯和双酯的产量;通过质谱、核磁共振光谱和红外光谱确定结构为2-氯丙醇酯,经峰面积法测定纯度为98%以上;三种单酯经圆二色谱验证为外消旋体。2-氯丙醇单酯和双酯的总产率约为50-54%和56-59%。2.通过优化色谱柱、流动相改性剂、自动背压调节器(ABPR)压力、柱温和洗脱梯度,改进了超临界合相色谱串联飞行时间质谱(UPCC-q TOF)分析2/3-氯丙醇单酯的方法,加入改性剂后的最佳方案为:采用2-PIC(2-甲氨基吡啶)色谱柱,流动相改性剂为甲醇;ABPR:1800 psi,柱温:50℃;流速1 mL/min;梯度洗脱:0.5-10%甲醇。该液相方法时间为12 min,对于不同的脂肪酸,2-氯丙醇单酯或3-氯丙醇单酯有很好的分离效率;同时对同一脂肪酸对应不同的3-/2-氯丙醇单酯也有较好分离度。检测氯丙醇酯生成模式反应中,甘单酯、甘二酯和甘三酯生成3-/2-氯丙醇单酯比值为:2.9-4.5:1。3.通过最大限量法测定P-2-MCPD和PP-2-MCPD对Swiss小鼠的急性毒性,结果显示,给予2-氯丙醇酯后14天Swiss小鼠无一死亡,P-2-MCPD 和 PP-2-MCPD 的 LD50 均大于 5000 mg/kg BW。根据 GHS(全球化学品统一分类和标签制度)等分类标准P-2-MCPD和PP-2-MCPD均应被划归为无毒化合物类(Nontoxic compounds)。与空白组相比,P-2-MCPD和PP-2-MCPD组Swiss小鼠血清中睾酮含量显著降低;组织病理学分析发现高剂量的P-2-MCPD和PP-2-MCPD(5000 mg/kg BW)导致Swiss小鼠轻微的肾损伤和睾丸损伤,由此推测睾丸可能是2-氯丙醇酯的靶器官。4.通过MTT法测定细胞活性发现五种2-氯丙醇酯均对TM3的存活率产生影响,且存在剂量反应关系。LDH(乳酸脱氢酶)测定结果表明P-2-MCPD在40-320μM之间显著提高TM3细胞的LDH释放量,而且存在剂量-反应关系。Western blotting结果显示,2-氯丙醇棕榈酸单双酯能使Cleaved caspase 3在给药后6 h和24 h表达量有显著变化,而且有时间反应关系。综上所述,2-氯丙醇酯能显著降低小鼠睾丸间质细胞TM3存活率,其中P-2-MCPD和PP-2-MCPD对细胞存活率的影响最为显著,而且P-2-MCPD致毒机理可能与Cleaved caspase 3蛋白介导的细胞凋亡有关。