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研究背景和目的肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是一种常见原发性恶性肿瘤,具有高转移率和高复发率。尽管近年来肝癌的治疗手段有了明显进展,但治疗效果仍不尽如人意,患者的生存质量、存活时间都没有显著改善。不同于传统的肿瘤血供模式,血管生成拟态(vasculogenic mimicry,VM)是一种独特的肿瘤微循环模式,并且往往关联着肿瘤的侵袭、转移以及不良预后。在VM形成的分子机制中,有较多的观点支持上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)参与其中,但两者之间的调控机制仍不明确。本研究旨在通过分析EMT转录因子ZEB2在人肝癌中表达和预后价值,初步揭示ZEB2与VM的关系;通过研究细胞因子TGF-β1对体外肝癌细胞的诱导作用,进一步证实EMT参与肝癌VM形成;通过研究ZEB2对细胞功能的影响,探讨ZEB2调控的EMT在肝癌血管生成拟态形成中的可能作用机制。方法1)通过特殊染色方法—CD31/PAS双重染色方法标记肝癌组织中VM管道结构。免疫组织化学染色检测人肝癌组织中ZEB2的表达并分析ZEB2与VM形成、临床病理参数的关系以及预后价值。2)选取不能形成管道样结构的肝癌Hep G2细胞系,用细胞因子TGF-β1诱导培养,观察诱导前后细胞形态和成管能力的变化。3)Western blot检测TGF-β1诱导培养后的肝癌细胞EMT转录因子Twist1、Snail、Slug和ZEB2的表达情况;检测EMT相关分子E-cadherin,Vimentin及内皮相关分子VE-cadherin的表达情况。4)Western blot检测四种肝癌细胞系Hep G2,Bel7402,PLC和SMMC7221中ZEB2的表达情况。5)筛选出低表达和高表达ZEB2的肝癌细胞系,分别上调和下调ZEB2的表达,并观察ZEB2高、低表达对细胞成管能力及内皮相关分子表达的影响。6)Western blot和免疫荧光染色检测ZEB2高、低表达对肝癌细胞EMT相关分子E-cadherin、Vimentin表达的影响。7)细胞划痕和侵袭实验检测ZEB2高、低表达对肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响。8)明胶酶谱检测ZEB2高、低表达对肝癌细胞MMP-2和MMP-9活性的影响。结果1)92例人肝癌组织样本中发现17例存在VM,其发生率为18%。免疫组化染色发现ZEB2细胞浆表达53例(57.6%),ZEB2核表达21例(22.8%)。ZEB2核表达VM形成、临床分期和肝癌患者的复发/转移有关(P<0.05)。生存分析提示具有ZEB2细胞核表达或者VM阳性的肝癌患者总生存期均较短。多因素分析结果表明ZEB2是肝癌患者总生存期的独立预后因素(P<0.05)。2)TGF-β1诱导培养肝癌Hep G2细胞,细胞由典型的上皮样表型转变为间充质样表型并获得了形成管道样结构的能力,能在体外形成VM样结构。3)TGF-β1诱导培养后的Hep G2细胞EMT转录因子ZEB2的表达显著增强,而对Twist1、Snail和Slug的影响不明显;间叶标记分子Vimentin表达增高,而上皮标记分子E-cadherin表达下降;内皮相关分子VE-cadherin表达增高。4)Western blot检测证实在四种肝癌细胞系HepG2,Bel7402,PLC和SMMC7221中,Hep G2细胞低表达ZEB2,Bel7402,PLC和SMMC7221细胞均有较高的ZEB2表达,其中Bel7402细胞表达最高。5)HepG2细胞上调ZEB2表达后在三维培养下能够形成管道样结构并表达内皮相关分子VE-cadherin、Flt-1、Flk-1;Bel7402细胞下调ZEB2表达后形成管道样结构的能力消失并且VE-cadherin、Flt-1、Flk-1的表达显著下降。6)上调ZEB2表达使Hep G2细胞间叶标记分子Vimentin表达增高,而上皮标记分子E-cadherin表达下降;下调ZEB2表达使Bel7402细胞间叶标记分子Vimentin表达下降,而上皮标记分子E-cadherin表达增高。7)上调ZEB2表达能够增强肝癌Hep G2细胞侵袭和迁移能力。下调ZEB2表达降低肝癌Bel7402细胞的侵袭和迁移能力。8)上调ZEB2表达能够增强肝癌Hep G2细胞MMP-2和MMP-9的活性;下调ZEB2表达降低肝癌Bel7402细胞MMP-2和MMP-9的活性。结论1)通过免疫组化及统计学分析证实ZEB2与VM形成有关;ZEB2还与肝癌复发、转移等恶性生物学行为有关,是影响患者生存的独立预后因素。2)体外实验通过TGF-β1诱导培养肝癌细胞,证实其能够通过显著上调ZEB2的表达诱导肝癌细胞发生EMT,并且促进体外形成VM样结构。3)体外实验通过构建ZEB2上、下调细胞模型,证实ZEB2能够增强肝癌细胞的侵袭、迁移性和三维管状结构形成能力。4)体外实验亦证实ZEB2能够增强肝癌细胞MMP-2和MMP-9的活性,上调内皮相关分子VE-cadherin、Flt-1、Flk-1的表达,从而促进VM形成。