研究背景：肝细胞肝癌(Hepatocelluar carcinoma，HCC)是恶性度很高的肿瘤，在肿瘤致死原因中位列第三。手术切除仍是治疗的首选方法，但由于手术后复发率高，肝细胞肝癌行手术治疗的预后仍不十分理想。虽然近年来肿瘤分子生物学的快速发展，出现了多种能够预测HCC术后复发的分子标记物，但至今仍没有公认的分子标志物应用于临床。因此，急需寻找新的HCC预后的标志物，从而更好的理解HCC术后复发转移的机制，使我们能够更好地预防肿瘤复发，进而延长病人预期寿命,改善HCC患者的预后。三羧酸循环(Tricarboxylic acid cycle，TCA循环)途径发生在线粒体中，该途径是细胞氧化供能的最终途径，也是糖、脂肪和氨基酸代谢的重要途径。包括三羧酸循环在内新陈代谢重新编排是肿瘤细胞的重要特点。而且最近的基因组学研究表明：三羧酸循环中的关键激酶，琥珀酸脱氢酶(Succinate dehydrogenase， SDH)、延胡索酸水化酶(Fumaric acid hydratase, FH)和异柠檬酸脱氢酶(Isocitratedehydrogenase, IDH)及其代谢产物参加到肿瘤发生的过程中。而且有研究表明SDH,FH和IDH编码基因突变与多种肿瘤发生有关，例如：乳腺癌、膀胱癌、肾癌、脑胶质瘤。单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism, SNPs)代表了不同人之间遗传背景的差别。因其易获取标本，只需外周血；检测方便，成本低，容易实现高通量检测；且性质稳定，因此广泛应用于各种疾病发生、发展及预后的研究。SNP技术也同样应用在肝细胞肝癌发生、进展及预后的研究中。多种基因的多个位点被用于肝细胞肝癌的研究当中。然而，SDH, FH和IDH基因单核苷酸多态性(SNPs)与肝细胞肝癌(HCC)预后之间的关系至今无人研究。研究目的：本研究通过探讨SDH, FH和IDH基因中的功能性SNP位点(Functional SNPs)与汉族人群中肝细胞肝癌行手术切除患者预后间的相关性，并通过功能实验，验证此相关性。从而为汉族人群中肝细胞肝癌预后的评估提供新的潜在分子标志物。研究方法：基于SNP公共数据库资源，本研究首先预测汉族人群中SDH、FH和IDH3个基因上功能性SNP位点。回顾性收集2009年1月至2012年1月，第二军医大学上海东方肝胆外科医院收治的经病理诊断证实为肝细胞肝癌行手术切除患者492例，收集所有患者基本临床信息，主要包括：年龄、性别、乙肝表面抗原的有无、甲胎蛋白(AFP)水平、肿瘤大小、肿瘤数目、肿瘤分化的程度、肿瘤分期(TNM分期和BCLC分期)、门静脉癌栓（PVTT）的有无及是否行预防性TACE治疗等，并通过再次入院治疗的住院病历、门诊复诊的门诊病历及定期电话回访等方式收集患者预后信息，随访截止日期为2013年1月。所有患者均签署知情同意书，本研究通过了上海东方肝胆外科医院伦理委员会批准。每位患者抽取外周血5ml，按照第一部分所述方法，制备全基因组DNA，同时应用MassARRAYTM飞行时间质谱生物芯片系统对492例患者行SNP分型。荧光素酶报告实验用来验证位于SDHC基因3’UTR区的rs3935401位点的功能。首先合成44-bp长携带rs3935401野生型与突变型的双链寡聚核苷酸，然后用限制性内切酶Spe I和Hind III(Takara, Dalian, China)。将这些片段克隆入pMIR报告载体(Ambion, Austin, Tex)中。所有的重组载体均进行DNA测序验证。然后将验证后的重组报告载体pMIR-rs3935401-A (200ng/well)或pMIR-rs3935401-G (200ng/well)，应用脂质体2000(Invitrogen, Carlsbad, Calif)转入人肝细胞肝癌细胞系SMMC-7721和HepG2以及人胚肾细胞系HEK-293T (American Type CultureCollection)。48小时后，用带有发光计(Tecan, Mannedorf, Switzerland)的双荧光报告检测系统工具(Promega)检测这些细胞荧光活性。所有的转染实验一次进行3组，所有的实验均独立进行3遍。应用SPSS Statistics19.0(IBM SPSS,19.0)软件进行统计分析, t检验用于比较两组均数间的差异，卡方检验用于比较分类变量间的差异。多因素的COX回归风险比例模型用于分析SNP位点与总体生存时间与无复发生存时间的相关性，Kaplan-Meier曲线及Log-rank检验用于比较不同组间总体生存时间与无复发生存时间的差异。分别应用三种遗传模型(additive, dominant, and recessive)行相关性分析，以取得最小P值得的模型定义为最佳模型。所有的检验均为双侧检验，P <0.05定义为有统计学差异。研究结果：本研究选取了3个酶编码基因上18个SNP位点，由于IDH基因上rs9708193位点检出率低于90%，不再进入后续分析。各临床参数中甲胎蛋白(AFP)水平升高、肿瘤大于5cm、肿瘤为多个、肿瘤分化差、肿瘤分期晚、门静脉有癌栓(PVTT)患者复发、死亡率均显著高于对应的另外分组患者。总体复发分析发现，SDHC基因上的rs12064957位点在recessive模型(HR,2.01;95%CI,1.02-3.96, P=0.044)、rs3935401在additive模型下提示患者高复发(HR,1.24;95%CI,1.00-1.53, P=0.049)。SDHD基因上的rs544184、 rs7121782和rs10789859位点均在dominant模型下提示患者高复发，经连锁不平衡分析发现，三个位点存在强连锁，因此选择rs10789859进入后续研究。FH基因上的rs1414493位点在dominant模型提示好的预后(HR,0.77;95%CI,0.61-0.97, P=0.030)。 IDH2基因上的rs11540478位点与肝癌患者的总体复发显著相关(HR,0.76;95%CI,0.61-0.95, P=0.015)。而且这些位点的预后不良基因型同样表现出了剂量依赖效应（P=1.69x10-6)。同时生存树分析表明，SDHD基因上的rs10789859位点是肝细胞肝癌总体复发的起始危险因素。进一步分层分析发现，单纯手术治疗人群中，SNP位点不良预后的低危组的无复发生存时间明显优于高危组（log-rank P=2.2*10-5）；在TNM分期Ⅰ期和Ⅱ期的人群中，低危组的预后明显优于高危组（log-rank P=7.4*10-5）；在不良预后SNP位点高危人群中，手术联合TACE治疗的无复发生存时间明显优于单纯手术治疗组（log-rank P=6.6*10-4）。总体生存分析发现，SDHC基因上的rs3935401位点的突变型在additive模型下提示预后不良(HR,1.64;95%CI,1.27-2.12, P=1.5x10-4)，SDHC基因上的rs4131826位点在dominant模型下提示好的预后(HR,0.72;95%CI,0.53-0.97, P=0.032)，FH基因上的rs1414493位点在dominant模型下提示好的预后(HR,0.73;95%CI,0.54-0.98, P=0.035)，IDH1基因上的rs12478653位点(HR,0.73;95%CI,0.53-1.00, P=0.047)和IDH2基因上的rs11540478位点(HR,0.68;95%CI,0.50-0.92, P=0.011)分别在dominant和additive模型下提示好的预后。将这些位点的预后不良基因型建立累积效应模型分析显示，这些位点的预后不良基因型表现出了剂量依赖效应，随预后不良基因增加，患者预后越差(P=5.8x10-8)。同时生存树分析表明，SDHC基因上的rs3935401位点是肝细胞肝癌总体生存的起始危险因素。且该位点位于3’UTR，此位点可使SDHC基因与miRNA的结合发生改变，这一改变影响了SDHC基因的mRNA转录。双荧光报告载体实验结果显示：转染rs3935401位点突变型载体后，较转染野生型载体，SMMC-7721(P <0.001)、 HepG2(P=0.046)和HEK-293T(P=0.022)三个细胞系中荧光活性显著降低。研究结论：本研究的结果表明，三羧酸循环关键激酶SDH、FH、IDH编码基因多个单核苷酸多态性与肝细胞肝癌行手术切除治疗患者的总体复发与生存显著相关。进一步的荧光报告载体实验显示，突变型位点的基因表达显著降低，这也证实了单核苷酸多态性对基因功能的影响。还需要进一步的功能实验及前瞻性的研究来证实本研究中的结论，从而推动其临床应用。