研究背景:恶性肿瘤严重威胁着人类的健康,从微观层面的肿瘤细胞转移到宏观水平的肿瘤组织硬化,力学因素广泛地存在于肿瘤发生发展的各个阶段、尺度。研究肿瘤细胞力学可以为肿瘤的临床诊疗提供新的思路,具有重要的科学价值。乳腺癌作为全球女性健康的头号“杀手”,其发生发展过程中的力学微环境也在不断地改变。但受到现有力学检测方法的限制,很少有研究关注到这一过程中乳腺癌细胞或组织的力学变化,从而忽略了这一潜在的治疗突破口。目前肿瘤细胞力学研究较多的集中在细胞外基质或肿瘤微环境中的力学因素对肿瘤细胞生物学行为的影响,但是较少涉及肿瘤细胞自身的力学性质（如刚度等）对肿瘤发生发展的影响。其中缺少简单易行的细胞力学检测方法是主要原因之一,而现有的细胞力学检测方法难以进行跨时间和空间尺度的测量,且通常需要特殊的实验装置以及复杂的计算,这大大限制了这类技术的使用。因此,急需发展实时、高分辨率且低成本的细胞力学检测方法。光子晶体是由不同折射率的电介质材料周期性排列而形成的人工微结构,有序结构的光子带隙特性可以赋予材料鲜亮的结构色。将光子晶体的光子带隙特性与水凝胶材料的可变形性相结合,制备力致变色光子晶体水凝胶,可以将复杂的力学信号转化为可读的光谱信号,利用布拉格衍射方程和非密堆积结构的空间位置,结合弹性材料的力学规律,即可用于细胞力学的检测。研究目的:本课题旨在制备可用于细胞力学检测的光子晶体水凝胶薄膜,将其集成至光学显微镜内,形成一套集材料制备、光学成像、计算机图像处理和力学理论计算于一体的细胞力学检测系统。并以此为核心技术,开展乳腺癌细胞的力学生物学研究。探究新型“力学标志物”在细胞筛选及药物筛选中的应用,以及上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）过程中细胞力学特性的变化及力学调控机制。拓展细胞力学的内涵,增加力学检测方法在生物学中的应用场景及基于力学特征的抗肿瘤治疗策略。研究方法:1.将Si O2粒子与聚丙烯酰胺水凝胶结合,利用紫外聚合法制备非密堆积型光子晶体水凝胶薄膜。通过调整预聚液中各组分的配比以及聚合参数,得出最佳制备条件。利用扫描电镜、光纤光谱仪、纳米压痕仪对薄膜的结构及理化特性进行表征。根据表征结果及弹性力学理论,构建基于“色相-光谱-形变-力”的模型算法,用于细胞对基底应力大小的计算。通过在普通光学显微镜内加载反射滤光片,外接宽光谱卤素灯光源及图像采集设备,构建光子晶体水凝胶薄膜细胞力学显微镜系统（以下简称:光子晶体力学显微镜系统）。获取负载力学信息的图像后,由MATLAB（matrix laboratory）软件完成信息提取、计算及结果输出。2.通过光子晶体力学显微镜系统分别检测良性乳腺上皮MCF-10A细胞、低侵袭性乳腺癌MCF-7细胞、高侵袭性乳腺癌MDA-MB-231细胞对基底应变的分布,探索以“力学标志物”进行细胞筛选的可行性。将光子晶体力学显微镜法与CCK-8法（cell counting kit-8）、免疫荧光染色法比较,检测紫杉醇对MDA-MB-231细胞的力学特性、细胞存活率及细胞骨架的影响。3.设计经典的“圣诞树”型浓度梯度微流控芯片,将光子晶体水凝胶薄膜集成至芯片内,利用光子晶体力学显微镜系统实时检测芯片内不同通道的MCF-7细胞受到不同浓度紫杉醇作用后的力学变化。在芯片外,采用CCK-8法检测相同浓度和时间作用下,紫杉醇对细胞存活率的影响。4.使用转化生长因子-!1（TGF-!1）诱导MCF-7细胞发生EMT,光子晶体力学显微镜系统检测EMT进程中MCF-7细胞对基底的应力变化,免疫荧光染色观察细胞骨架的形态变化,Transwell小室检测细胞侵袭能力的变化,Western Blot检测Tiam1-Rac1-Cortactin-Arp2/3通路蛋白的变化。使用小干扰RNA技术敲低Tiam1分子后,检测EMT进程中细胞对基底应力的变化以及相应通路蛋白表达的变化,以明确Tiam1在EMT过程中的力学调控作用。分别用5μM微管抑制剂Nocodazole及10μM选择性非肌球蛋白II抑制剂Blebbistatin处理MCF-7细胞,使其力学特性发生改变后,利用Western Blot检测细胞上皮表型标志物及间质表型标志物的蛋白表达变化。研究结果:1.创新性地使用“压印法”成功制备了厚度约为24μm,且固定于玻片上的光子晶体水凝胶薄膜,解决了薄膜观察、取用的问题。利用Si O2粒子的体积分数为41%、水凝胶网络的交联度为5.5%、丙烯酰胺质量分数为60%、水凝胶组分质量分数为4.8%的预聚液所制备的薄膜具有最优的细胞力学检测能力。薄膜的扫描电镜结果显示粒子呈现高度有序排列,实物呈现鲜艳的绿色,其反射光谱的反射峰对应的波长约为515nm,薄膜的硬度均一且稳定,弹性模量约为22.7±2.1k Pa。薄膜成功集成至光子晶体力学显微镜系统,由相应算法计算得到的MCF-7细胞对基底单位面积的平均下压应力为2.1±0.4k Pa。2.基于力学特性表征良恶性程度不同的乳腺上皮细胞之间的差异,结果发现:良性MCF-10A细胞对基底的应变分布范围较广,为0%-25%,在1%-2%存在一个峰值。而乳腺癌细胞的应变分布范围为0%-15%,且低侵袭性的乳腺癌MCF-7细胞的应变分布较为平均,高侵袭性的MDA-MB-231细胞的应变分布较集中在低应变（1%-3%）区域。200n M紫杉醇处理MDA-MB-231细胞后,在12h及更长的时间才能检测出明显的活力下降及微管的聚合,而使用光子晶体力学显微镜法在药物作用初期（数分钟）即可观察到明显的力学改变。3.成功将光子晶体水凝胶薄膜集成至“圣诞树”型浓度梯度微流控芯片内,实现了芯片内细胞对基底应力的实时检测。芯片内产生的紫杉醇浓度分别为:200n M、132n M、66n M、0n M,上述四个通道内的MCF-7细胞对基底的应力随时间变化的趋势与细胞存活率随时间变化的趋势一致,表明细胞对基底的应力大小可以作为一种新型“力学标志物”,纳入到抗肿瘤药物筛选标准中。4.10 ng/m L TGF-!1可以诱导MCF-7细胞发生EMT。TGF-!1处理48h后,微丝骨架蛋白的排列发生了变化,倾向于形成片状伪足及丝状伪足。细胞对基底的平均应力由2.1±0.5 k Pa下降至1.4±0.3 k Pa,Tiam1-Rac1-Cortactin-Arp2/3通路蛋白表达增加,同时细胞侵袭能力增加。si RNA敲低Tiam1表达后,EMT过程中Tiam1-Rac1-Cortactin-Arp2/3通路蛋白表达减少,片状伪足及丝状伪足形成的趋势减弱,细胞对基底应力下降的比例小于未敲除组。5μM Nocodazole作用24h使MCF-7细胞对基底应力由1.9±0.2 k Pa增加至5.5±0.3 k Pa,而10μM Blebbistatin使细胞对基底应力由2±0.3 k Pa下降至0.6±0.3 k Pa。同时Western Blot结果显示,5μM Nocodazole处理使得MCF-7细胞E-Cadherin蛋白表达下降,N-Cadherin蛋白表达增高,细胞有发生EMT样表型转变的趋势,而10μM Blebbistatin处理对其细胞表型的转变无明显影响。研究结论:1.本论文所搭建的光子晶体力学显微镜系统成功实现了微纳尺度的细胞力学检测,且具有实时、高通量、高分辨率、低成本、操作简单等特点,易于产业化推广应用。2.细胞对基底的应力/应变大小可作为一种新型的“力学标志物”,进行乳腺癌细胞良恶性的甄别。相较于CCK-8法、免疫荧光法等传统分子生物学方法,使用光子晶体力学显微镜法检测出的力学变化可以作为一个更为敏感的指标纳入到评估抗肿瘤药物对肿瘤细胞的杀伤作用中。本研究成功构建“圣诞树型”微流控药物浓度梯度芯片,并可在芯片内基于力学特性进行抗肿瘤药物的筛选。3.EMT过程中,MCF-7细胞对基底的应力有变小的趋势,Tiam1通过Rac1-CortactinArp2/3通路来调控细胞骨架蛋白,进而引起细胞力学改变,发挥关键力学调控分子的作用。同时,细胞骨架的变化所引起的力学改变也可诱导其发生EMT样细胞表型转变。总之,EMT与细胞力学改变存在一个相互影响的网络关系。4.本研究有望为新型“力学标志物”的应用及抗肿瘤转移的力学疗法提供新的思路和研究策略。