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目的:研究三氧化二砷（As2O3）和顺铂（CDDP）联合应用对人肝癌HepG2细胞株凋亡的诱导作用,并且深入探讨其作用机制,从而为将三氧化二砷和顺铂联合应用于临床治疗肝癌提供更坚实的实验基础和理论依据,为肝癌的化学药物治疗探索出一条新的途径。方法:（1）利用MTT法（四唑蓝比色法）检测经不同浓度的As2O3和CDDP处理过的人肝癌HepG2细胞株的吸光度值（OD值）,计算细胞生长抑制率,并且绘制随药物浓度变化的细胞生长抑制曲线;同时通过计算两药相互作用系数（CDI）来评价两种药物的相互作用性质。（2）以不同浓度的As2O3和CDDP对人肝癌HepG2细胞进行处理,利用AO/EB荧光染色法观测肝癌细胞随药物剂量-时间变化的凋亡情况,形态学变化,并且计算药物诱导细胞凋亡率。（3）As2O3和CDDP单独及联合使用对肝癌HepG2细胞分别进行处理,采用即用型非生物素免疫组化ElivisionTM plus检测方法,结合计算机图像分析,检测Bax,Bcl-2,Fas蛋白在肝癌细胞中的表达情况。（4）采用流式细胞仪技术,观察和分析经过As2O3和CDDP两种药物处理后的人肝癌HepG2细胞株的细胞周期变化情况,以及细胞凋亡率。（5）利用端粒重复扩增实验（TRAP）技术结合非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染法,测定人肝癌HepG2细胞株经过As2O3和CDDP两种药物单用及联用不同时间后端粒酶活性的变化情况。结果:（1）不同浓度的As2O3（1μg/ml、2μg/ml和4μg/ml）和CDDP（0.25μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml和2.0μg/ml）单用药及联合用药组均可以抑制人肝癌HepG2细胞株的生长,并且具有明显的剂量-时效关系;同时观测到各联合用药组对肝癌细胞的抑制率均较各相应的单独用药组显著增强,其中低浓度联合用药组的抑制率增加更为明显:中低浓度的As2O3（2μg/ml）与CDDP（0.25μg/ml、0.5μg/ml和1.0μg/ml）联合应用对人肝癌HepG2细胞作用24h时,细胞抑制率分别为:35.54%,41.77%,44.34%;作用48h时,细胞抑制率分别为:62.14%,66.43%,69.43%;作用72h时,细胞抑制率分别为:67.84%,77.93%,84.48%。（2）细胞形态学的改变:在荧光显微镜下,可以观察到对照组细胞呈现弥散而均匀的荧光,而经过As2O3和CDDP共同处理过的细胞则出现大量典型的凋亡细胞,凋亡细胞内可见到明显的核碎裂现象,并且其核内可见染色浓度改变的颗粒状荧光。计算200个细胞的细胞凋亡率,结果显示:细胞凋亡率变化具有一定的剂量-时效性;单独使用As2O3低浓度组（1μg/ml）与对照组比较差异没有显著意义（P=0.071）,单独使用CDDP中低浓度组与对照组比较差异有显著意义（P＜0.05）;而As2O3和CDDP联合用药组,在药物浓度较低时凋亡细胞的比例就已经很高。（3）As2O3和CDDP对人肝癌HepG2细胞株的Bax、Bcl-2与Fas三种基因表达影响的研究表明,两种药物作用的浓度和时间与这三种基因的表达有密切的关系。低浓度As2O3（1.0μg/ml）和CDDP（0.25μg/ml）在早期（24h）即可以使这三种基因的表达发生变化,但并不十分明显。随着药物浓度增加以及作用时间延长,基因的表达发生较明显的变化:实验组肝癌细胞的Bax和Fas基因的表达明显增加,Bcl-2基因的表达明显降低,而对照组肝癌细胞Bcl-2基因表达增加,Bax,Fas基因的表达率较低。同时通过研究发现As2O3和CDDP两药合用组对三种基因表达的影响要强于两药单独用药组,表达差异均有显著统计学意义（P＜0.05）。（4）流式细胞仪分析结果显示As2O3和CDDP各用药组在DNA组方图上均可见在G1期细胞前凋亡细胞呈现典型特征性的亚二倍体凋亡峰（Sub-G1峰,即AP峰-apoptotic peak）,联合用药组的凋亡数值要高于各单独用药组,由此可以说明As2O3和CDDP均有诱导肝癌细胞凋亡的作用,两药联合应用时诱导细胞凋亡的作用大大增强,并且可以使S期细胞减少,将细胞生长周期阻滞于G2/M期。（5）通过端粒酶活性的检测发现,As2O3和CDDP两种药物单用及联用组作用24h时,人肝癌HepG2细胞的端粒酶检测结果为阳性;作用48h时,各单药组端粒酶检测仍然为阳性,联合用药组的端粒酶活性则有一定程度的抑制;各单独用药组作用72h后端粒酶检测结果还为阳性,而联合用药组作用72h后端粒酶检测则为阴性。由此可以说明,联合用药组24h尚不能阻断端粒酶的活性,其原因可能为药物浓度较低,作用时间较短;在48h时则可以部分阻断端粒酶活性,但作用72h后即可以完全阻断端粒酶活性,相比较各单独用药组阻断端粒酶活性的作用均明显增强,可见这两种药物阻断端粒酶活性的作用具有一定的剂量-时效性,随着药物浓度提高和作用时间延长其抑制作用增强。结论:（1）本实验证明,在体外As2O3和CDDP两种药物联合应用具有明显的协同抗肝癌作用,可以显著抑制人肝癌HepG2细胞株的生长,并且具有明显的剂量-时效关系。（2）As2O3和CDDP两种药物联合应用抑制人肝癌细胞生长的作用在于其选择性诱导肝癌细胞的凋亡,且联合用药组的诱导凋亡率明显高于各单独用药组,说明两药联用有显著的协同诱导肝癌细胞凋亡的作用。在药物浓度方面,如果将本实验中联合组所用浓度再降低一些,是否亦能获得与单独用药时相当或更好的疗效,还有待进一步验证。（3）As2O3和CDDP两种药物诱导肝癌细胞凋亡的作用与Bax,Bcl-2,Fas基因的表达改变有关,其增强了促进凋亡基因Bax,Fas的表达,下调了抑制凋亡基因Bcl-2的表达,Bcl-2与Bax的比例减少,这是其诱导肝癌细胞凋亡的重要分子机制之一。（4）As2O3和CDDP两种药物联合应用可以改变肝癌细胞周期,使人肝癌细胞S期细胞减少,将细胞生长周期阻滞于G2/M期,阻止细胞的有丝分裂,从而延长细胞周期时间,这亦是其诱导肝癌细胞凋亡的重要机制之一。（5）As2O3和CDDP联合应用增强了抑制端粒酶活性的作用,从而抑制了肝癌细胞的生长,而端粒酶表达的抑制可能出现在凋亡之前,而不是凋亡的结果,所以端粒酶活性的抑制与肝癌细胞凋亡之间的关系尚不是十分明确,是否为As2O3和CDDP对端粒酶活性的抑制而启动肝癌细胞的凋亡过程有待进一步探讨。（6）本实验证明As2O3和CDDP在体外可以抑制肝癌细胞的生长,诱导肝癌细胞凋亡,两药联合应用体现了中、西医药结合的特色与优势。因此,很有必要继续进行动物体内实验及临床试验,从而为将这两种药物组合最终广泛应用于临床治疗肝癌提供更加坚实可靠的实验基础和理论依据,为肝癌的化学药物治疗探索出一条新的具有广阔应用前景的道路。