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猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type2，PCV2)属于圆环病毒科圆环病毒属，其基因组为单链环状DNA，大小为1767bp，无囊膜结构，是最小的动物病毒之一。PCV2能引起猪圆环病毒相关疾病(porcine circovirus-associate disease，PCVAD)，严重影响养殖业的发展。PCV2的ORF3蛋白已被证实与细胞凋亡和病毒的致病性有关。本研究旨在构建新分离PCV2流行毒株的重组病毒及其不表达ORF3的重组病毒，并分析它们的基本生物学特性，为后续深入开展致病机制研究奠定基础。 1.PCV2流行毒株的序列测定与分型 对上海某猪场PCV2流行毒株进行分离和测序，并与上海周边地区毒株序列进行了比较，绘制系统进化树。结果表明:该毒株为PCV2b型，与上海及周边地区的毒株在同一个进化分支，序列同源性在95％-99.9％。表明该地区流行的PCV2毒株为致病较强的PCV2b型。 2.重组病毒rPCV2-SH和不表达ORF3的rPCV2-SHmuORF3的构建 利用反向遗传学技术构建了包括Cap重复序列的感染性克隆以获得重组病毒rPCV2-SH，应用点突变的方法构建不表达ORF3的重组PCV2毒株rPCV2-SH-muORF3。将亲本株rPCV2-SH和rPCV2-SHmuORF3体外盲传14代后，进行病毒滴度测定，病毒的TCID50分别为10-42/ml和10-39/ml(P＞0.05)，表明缺失ORF3的表达不影响病毒复制;荧光定量PCR结果表明ORF3不表达后，病毒复制减慢，但与亲本株相比并无统计学差异(P＞0.05)。 3.ORF3在PCV2致病中的作用 将亲本株rPCV2-SH和rPCV2-SH-muORF3分别用MOI=1感染细胞36h，用TUNEL法测定细胞的凋亡情况。结果表明不表达ORF3的重组病毒细胞凋亡数显著低于亲本毒株(P＜0.01);6周龄雌性BALB/c小鼠腹腔注射105TCID50的亲本株和突变株，接种后21天，病理组织切片显示亲本株可引起明显的淋巴结和脾脏的组织细胞浸润，并伴有淋巴细胞减少等病理变化;而ORF3缺失的重组病毒引起的病理变化相对比较轻。免疫组化结果也进一步表明淋巴结和脾脏组织中亲本株的病毒量要明显高于ORF3不表达的重组病毒。 综上所述，本研究成功构建了PCV2流行毒株和不表达ORF3的重组病毒，初步证明ORF3在细胞凋亡中起一定作用，ORF3缺失不影响病毒复制。这些结构为后续进一步研究PCV2的复制和致病机理奠定了基础。