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研究目的放疗对于许多不能手术切除的肿瘤是重要的局部控制手段,包括胃癌。使用放疗增敏剂可以提高放疗的疗效。通过靶向纳米材料投递放疗增敏剂可以进一步提高放疗获益。本文根据这一领域的发展趋势和所存在的不足,拟从两个方面进行研究:(1)将负载多西他赛的明胶酶靶向纳米粒子与多西他赛小分子剂型对比,比较两者在胃癌中的体内外放疗增敏作用,并对两者放疗增敏差异的机制在细胞水平进行探讨;(2)将己经被证实有抑制肿瘤干细胞样特性的miR-200c,利用明胶酶靶向纳米粒子进行投递,对其在胃癌中细胞水平的放疗增敏作用进行考察,并从抑制肿瘤干细胞特性的角度对其放疗增敏作用的机制进行探讨。研究方法:制备负载多西他赛的明胶酶靶向纳米粒子。通过免疫印迹法考察三种胃腺癌细胞(BGC823、SGC7901、MKN45)与正常胃黏膜上皮细胞(GES-1)的明胶酶表达,分别考察两者对纳米粒子的细胞摄取。通过克隆形成实验和MTT实验,比较纳米药物和多西他赛小分子剂型对两者的细胞毒作用和放疗增敏作用。通过流式细胞仪检测、免疫印迹法等方法,在胃腺癌BGC823细胞中,从细胞周期时相、活性氧、DNA双链损伤及修复、凋亡等方面对两者放疗增敏作用差异的机制进行探讨。以裸鼠BGC823皮下瘤模型,比较多西他赛纳米粒子或多西他赛小分子剂型联合放疗时,对肿瘤生长和裸鼠体重变化等的影响。制备负载miR-200c的明胶酶靶向纳米粒子。通过细胞摄取实验和实时荧光定量PCR实验,对比胃腺癌细胞与正常胃黏膜上皮细胞中的miR-200c纳米粒子的摄取水平和miR-200c表达变化。通过克隆形成实验和MTT实验,比较miR-200c纳米粒子和miR-200c裸药对胃腺癌细胞与正常胃黏膜上皮细胞的放疗增敏作用。miR-200c纳米粒子处理后,对人胃腺癌BGC823细胞中肿瘤干细胞标志CD44和上皮标志钙黏蛋白-E表达变化,通过PCR和免疫印迹法从mRNA和蛋白水平进行了检测;BGC823中CD44阳性的细胞比例变化通过流式细胞仪进行了检测;干细胞样特性和干细胞相关放疗抵抗机制的变化也进行了考察。结果胃黏膜上皮细胞系GES-1与三种胃癌细胞系相比,细胞内和分泌的明胶酶(MMP-2/9)含量均较少。明胶酶纳米粒子的摄取实验中,明胶酶高表达的BGC823细胞的摄取量较明胶酶表达缺乏的GES-1细胞明显升高。在三种胃癌细胞系,多西他赛纳米粒子的细胞毒作用明显优于其小分子剂型(P<0.05);而在正常胃黏膜上皮细胞GES-1中,两者有相似的细胞毒作用(P>0.05)。相似的是,在三种胃癌细胞系,多西他赛纳米粒子明显提高了其小分子剂型的放疗增敏效果(放疗增敏系数增加1.09倍到1.24倍,P<0.01);在GES-1细胞中,放疗增敏效果并没有因使用纳米粒子投递而明显增高(1.02倍,P=0.38)。在BGC823细胞中,我们观察到多西他赛纳米粒子更强的G2/M阻滞作用、更多的细胞内活性氧生成、更高效的DNA双链损伤和更高比例的放疗致细胞凋亡。更重要的是,裸鼠BGC823皮下瘤模型中,相同的非抑制性浓度下,多西他赛纳米粒子较多西他赛小分子剂型有更加优越的放疗增敏效果;关于体重变化的观察提示多西他赛纳米粒子的全身毒性可能更温和。细胞摄取实验中,明胶酶过表达的BGC823细胞中负载罗丹明-B的明胶酶靶向纳米粒子所发出的荧光较明胶酶表达缺乏的GES-1细胞强度明显增强。PCR结果显示在BGC823细胞中经miR-200c NPs作用后,细胞中的miR-200c水平较未处理的对照组明显提高(对照组的40.3倍),而GES-1细胞经miR-200c NPs作用细胞中的miR-200c水平仅较对照组提高了 3.7倍。结合细胞摄取实验的结果,说明了 miR-200c NPs可以有效的、选择性的将miR-200c投递到明胶酶高表达的胃癌细胞中。miR-200c裸药对BGC823和GES-1细胞内的miR-200c水平中几乎没有影响。miR-200c纳米粒子明显提高了三种胃癌细胞系的放射敏感性(放疗增敏系数1.11到1.25),而在GES-1细胞中放疗增敏作用轻微(1.06)。而miR-200c裸药在四种细胞系中均未显示出放疗增敏作用。miR-200c NPs在BGC823中减少了表达CD44的细胞比例,总体的CD44 mRNA和蛋白水平也被下调;钙黏蛋白-E mRNA和蛋白水平被上调。同时,与放疗联用时,miR-200c NPs抑制了 BGC823细胞的干细胞样特性,包括侵袭能力和凋亡抗性。另外,BGC823细胞中的干细胞相关的放疗抵抗机制,包括活性氧水平和DNA损伤修复能力,也被miR-200c NPs削弱。结论在胃癌中,多西他赛纳米粒子较其小分子剂型在体内外均有更强的、更具选择性的放疗增敏作用,且这种放疗增敏作用的优势与一系列放疗损伤相关因素相关;纳米粒子使裸药时不能发挥功能的miR-200c实现了有效的、有选择性的放疗增敏,且这种放疗增敏作用与其抑制干细胞特性的功能相关。通过对肿瘤组织与正常组织微环境差异的认识和利用,明胶酶靶向纳米粒子可以对所负载放疗增敏剂进行肿瘤靶向性的投递,使放疗增敏剂对肿瘤的作用提高,而对正常细胞影响较小,有望实现放疗获益的进一步优化。本文为明胶酶靶向纳米粒子投递其它药物用于放疗增敏的研究提供了平台,为其进一步的向临床应用的转化研究提供了依据。