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‘三红蜜柚’【Citrus grandis Osbeck.‘Sanhongmiyou’】为云香科柑橘属植物,是从‘琯溪蜜柚’芽变单株选育出来的新品种。因红皮、红瓤、红肉而得此美名。其风味酸甜可口,营养价值高,‘三红蜜柚’果实在生长发育和采后贮藏期间容易发生汁胞粒化现象,这极大地影响了它的食用性和商品价值。现有大量研究表明随着汁胞粒化程度的加重,木质素的含量也随之增加,木质素的产生是柚汁胞粒化的主要因素之一,但到目前为止其发生的具体分子机制尚不明确。本研究拟从木质素代谢相关的转录因子角度来研究蜜柚汁胞粒化发生的机制。以‘三红蜜柚’果实汁胞为材料,结合生长发育过程中木质素含量的动态变化和建立的转录组数据库,鉴定并筛选参与木质素合成的关键转录因子,为探讨蜜柚汁胞木质素转录调控的研究奠定基础,为研究汁胞粒化发生机制提供重要途径。主要研究结果如下:1.柚汁胞在花后157-212 d木质素含量增加,且木质化的细胞壁出现增厚现象。‘三红蜜柚’果实随着花后天数的增长,其果重、横纵径均逐渐增大;汁胞木质素含量整体也呈上升趋势,在花后212 d近中柱的木质素含量比例达到最高为14.84%;采用Weisner试剂对果实汁胞进行切片染色,观察发现在粒化前期,细胞壁被染成淡红色,而在粒化后期染色程度慢慢加深逐渐染成深红色,表明在‘三红蜜柚’汁胞在生长过程中木质化的细胞壁中出现增厚现象。2.柚汁胞木质素合成关键NAC转录因子的筛选。研究通过选取花后157 d、180 d、212 d的近中柱和远中柱汁胞进行转录组测序,根据所有基因的转录水平,筛选的显著差异基因有3473个,主要富集在苯丙烷和次生代谢物的生物合成中。一方面通过差异基因在不同部位的趋势分析,结合KO和GO注释筛选出与木质素合成相关的转录因子。另一方面通过WGCNA与木质素含量进行关联分析,获得相关性基因有1287个,以木质素合成途径差异基因为节点筛选出关键NAC转录因子。3.NAC全基因家族成员的鉴定与分析。柚果实汁胞中共有105个NAC基因,基因分布在9条染色体上,柚NAC基因的串联重复事件发生概率较高,导致成员数量比较多,与拟南芥和枇杷间存在高保守的共线性片段。从‘三红蜜柚’果实汁胞克隆获得NAC基因并分别命名为Cg NAC012、Cg NAC043、Cg NAC076、Cg NAC073-1、Cg NAC073-2,通过亚细胞分析发现为核定位蛋白。通过q PCR分析发现这些基因在花后157-212 d近中柱、远中柱和粒化汁胞中的表达趋势基本相似。在花后157-212 d的表达量逐渐上升,在花后212 d上升且表达量达到最大,且在近中柱和粒化汁胞中的表达水平高于远中柱的汁胞。进一步在‘黄金蜜柚’成熟期的果实中进行分析,发现Cg NAC076在粒化汁胞中的表达水平与未粒化汁胞无显著差异,而Cg NAC012、Cg NAC043、Cg NAC073-1、Cg NAC073-2在粒化汁胞中的表达水平显著高于未粒化汁胞。4.Cg NAC043参与木质素的转录调控。通过与其他物种中已报道的木质素生物合成相关的转录因子进行聚类,发现Cg NAC043具有高度保守性。通过酵母双杂交系统,发现Cg NAC043在Y2H酵母中具有转录激活活性,且激活活性位于C端。瞬时转化Cg NAC043到蜜柚中果皮,发现可以促进下游Cg MYB58的表达。从柚汁胞中克隆得到的Cg MYB46、Cg C3H、Cg CCo AOMT1、Cg4CL、Cg CCR基因启动子长度分别为1827、2095、1961、1726、1949 bp。双荧光素酶结果表明,Cg NAC043不仅可以激活了Cg MYB46的启动子,激活倍数达到16.1倍;而且还可以直接激活Cg C3H和Cg CCo AOMT1的启动子,激活倍数分别是8.9、4.3倍。5.Cg NAC073-2促进木质素的生物合成。克隆得到的Cg NAC073-2启动子为1961 bp,通过双荧光素酶分析发现,Cg NAC012、Cg NAC043可以激活Cg NAC073-2的启动子,达到5.5、15.1倍。通过酵母双杂交系统,发现Cg NAC073-2在Y2H酵母中具有转录激活活性,且激活活性位于C端。构建p1301-Cg NAC073-2植物表达载体并转入烟草,发现过表达Cg NAC073-2表型株高普遍比WT高,叶片大而深绿,根系更加旺盛,茎秆更为粗壮。通过q PCR分析发现株系OE#2基因的表达水平最为显著,以WT作为对照,其中,Nt PAL、Nt C4H、Nt CCR、Nt COMT在叶片中表达量显著上调,分别是WT的2.01、2.88、3.47、1.62倍;Nt PAL、Nt C4H、Nt CAD、Nt CCR、Nt COMT、Nt CCOAOMT、Nt MYB86在茎中的表达量显著上调,分别是WT的1.78、2.20、1.80、3.25、5.35、1.92、16.70倍。对株系OE#2的茎段进行Weisner切片染色,发现表明OE#2的次生细胞壁比WT明显增厚。6.过表达Cg NAC073-2导致木质素中间产物的积累。利用LC-MS/MS分别测定OE及WT烟草中的根、茎、叶木质素合成中间产物的含量。其中,松柏醛、肉桂酸在OE叶片含量显著高于WT,分别是WT的8.14、8.95倍;4-香豆酸、阿魏酸、松柏醛、香豆醛在OE的根系含量显著高于WT,分别是WT的2.5、6.0、3.95、2.77倍;芥子酸、咖啡醇、咖啡醛在OE茎含量显著高于WT,分别是WT的2.84、6.37、41.51倍。以上结果表明,随着蜜柚汁胞在不同发育时期粒化程度的加重,Cg NAC043、Cg NAC073-2通过激活并促进下游转录因子及木质素合成基因的表达,从而共同参与蜜柚汁胞木质素合成的转录调控,为探讨木质素合成的研究奠定基础,为将来蜜柚的分子育种提供理论依据。