研究背景：急性腹泻病是危害儿童健康的常见病多发病,我国每年有8.36亿人次患腹泻,随着人们生活条件改善和卫生意识提高,腹泻病在人群中发病率有所下降。但是随着改革开放的不断深入,各种行业特别是餐饮娱乐、食品加工等行业的不断发展,在城乡结合部、城中村、农村等经济条件相对落后、人员构成复杂、流动性大的地区,腹泻病的发生情况仍不容乐观,其传播因素不断增多,传播途径呈广泛复杂的趋势。开发适用于基层人群、城乡结合地区的针对腹泻病原体的快速诊断方法,有计划、长期地、系统地对各种影响腹泻症发生、流行和变化的相关危险因素进行监测,准确掌握相关危险因素分布水平及分布特征,对疫情控制和预防有重要意义。病毒是导致急性非细菌性胃肠炎(acute gastroenteritis,AGE)的主要病原体,其中轮状病毒(Rotavirus,RV)、诺如病毒(Norovirus,NV)、星状病毒、腺病毒等已被确认是主要的致病原,其中轮状病毒所占比例最大。RV主要感染五岁以下的婴幼儿,在我国腹泻儿童中,大约有50%是由RV感染引起的。在季节分布上,我国主要发生在秋冬季,也称为婴幼儿秋冬季腹泻。在全球范围内,RV腹泻是引起发展中国家儿童死亡的重要原因之一。国内外大量研究表明NV是仅次于RV导致人类AGE的重要病原体,无论在发达国家还是在发展中国家都是导致儿童和老年人病毒性腹泻发病和死亡的重要原因。而随着RV疫苗的广泛使用,NV在病毒性腹泻的病原地位及所带来的疾病负担将越来越引人关注。NV可引起各年龄人群AGE的暴发与散发,在人口密集的公共场所如幼儿园、养老院、医院、饭馆、学校、游船等易引起暴发流行。在旅游者中腹泻是最常见的疾病,其病原体70%是NV,该病全年发生,但寒冷的冬季较多见。肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)和柯萨奇病毒A组16型(Coxsachie A16,CoxA16)是引起儿童手足口病(Hand-foot-and-mouth disease, HFMD)的主要病原体,这两种病毒主要通过粪-口、呼吸道和密切接触途径传播。CoxA16易出现暴发或流行,感染对象主要为5岁以下儿童。CoxA16和EV71的不同基因组或亚型轮流共同循环于亚洲太平洋地区,导致近20年来手足口病反复暴发。虽然CoxA16和EV71引起的手足口病并不以腹泻为主要临床表现,但二者是寄居于肠道内的病毒,如果我们能从普通腹泻病人粪便标本中检测到它们,对二者的病原学特性和致病性研究方面可能提出新的研究思路。研究目的：1.了解所监测城乡结合部社区的腹泻病患者粪便中RV、NV感染的流行病学特征及流行优势病毒株基因型；2.了解RV、NV病毒感染在该城乡结合地区的临床特征,及主要危险因素的分布情况；3.了解普通腹泻病人粪便中EV71和CoxA16的检出情况,并为其致病性研究提供新思路。研究方法：1.监测标本来源：2010年5月～2011年4月在广州市白云区某社区卫生服务站收集腹泻病患者的粪便标本,和患者的临床及流行病学资料。2. TD-PCR方法的评价：以实验室保存的NV、EV71和CoxA16阳性株作为阳性对照,并以常规PCR方法为参考,根据诊断试验的评价理论,不断摸索和优化同时检测NV、EV71、CoxA16病毒的TD-PCR方法；对TD-PCR阳性产物进一步做核酸序列同源性分析；A组RV用胶体金检测法检测。3.灵敏度评价：对逆转录后的cDNA进行10倍稀释,核酸测定仪紫外分光光度法测定三种病毒cDNA的最低检出浓度,从而探讨其用于检测该方法的灵敏度。4.特异度评价：对TD-PCR扩增产物进行测序分析,并用RV、札幌病毒(Sapovirus SV)、星状病毒(Astrovirus AstV)、伤寒杆菌(Salmonella typhi)、小肠结肠耶尔森菌(Yersinia enterocolitica Ye菌)、伤寒杆菌(Salmonellatyphi SE菌)、香港海鸥形菌(Laribacter hongkongensis LH菌)考察该方法的特异性。5.资料数据处理方法：用TD-PCR和普通PCR平行检测其中的NV、EV71和CoxA16病毒时,采用配对计数资料的X2检验比较两者优劣；RV、NV感染临床特征及危险因素的探讨,采用两样本比较研究；数据管理采用Epidata2.1进行双份录入,SPSS13.0进行统计分析,检验水准α=0.05,构成比资料采用X2检验。结果：1.2010年5月～2011年4月某社区卫生服务站共收治腹泻病患者244例,采集标本241份。根据监测情况：该病全年都有散发,但在夏天和秋冬时节病例较多,高峰在6月、10月和11月。其中男性161例,女性83例,男女患者性别比1.94：1。就诊者中,年龄最大59岁,最小的刚出生7天,主要集中在3岁以下儿童,占89.75%。2.哨点医院相关病毒监测结果：241份有效标本中,RV、NV、EV71、CoxA16这四种病毒均未检出者有120份,占49.8%；只检出其中1种者为107份,占44.4%；2种病毒交叉感染的有13份,占5.4%；1例患者感染RV、NV、EV71三种病毒；没有患者感染四种病毒。其中两种病毒交叉感染情况为：RV联合感染NV有11份,RV联合感染EV71有2份。3.RV阳性104例,占全部腹泻标本43.15%(104/241),男性71例,女性33例,性别比为2.15：1,不同性别之间RV检出情况差异无统计学意义(X2=0.429,P=0.513)；年龄最大59岁,最小41天,主要集中在3岁以下,不同年龄组之间RV检出率差异无统计学意义(X2=9.940,P=0.077)；根据监测情况：流行时间是8、11月,检出率高峰在8月和11月,检出率分别为20.19%(21／104),23.08%(24/104)。4.NV阳性28例,占全部腹泻标本11.62%(28/241)；其中男性14例,女性14例,男女患者性别比1：1；年龄最大22岁,最小48天,主要集中在3岁以下,不同年龄组之间NV检出率差异无统计学意义(X2=7.843,P=0.165)；检出率高峰在8月,为64.29%(18/28)。5.相关危险因素分析：RV或(和)NV检出组与均未检出组,两组腹泻病人在基本人口信息、粪便性状、临床表现和流行病学接触史方面差异无统计学意义。但在就诊时间,患者的职业构成以及呕吐情况方面,两组差异有统计学意义；病毒检出主要集中在8月和11月,检出组呕吐发生情况高于未检出组。6.初步建立了一个多功能TD-PCR检测体系：可用作一次快速检测粪便标本中NV、EV71和CoxA16,其反应体系为：DNA聚合酶12.5μl, cDNA 2μl,上游引物0.5μl,下游引物0.5μl,加灭菌双蒸水至总体积25μl。反应条件为：94℃预变性2 min,将退火温度设为55～45℃,每降落1℃进行2个循环,分别在不同的温度进行退火,在梯度降温的循环完成后,选45℃为最佳退火温度,94℃变性45s,45℃退火45 s,72℃延伸30s,再进行20个循环,72℃延伸10min。7.所设计的TD-PCR能检测出三种病毒cDNA最高稀释倍数分别为:NV 10-5, EV71 10-5, CoxA16 10-4(而普通PCR扩增最高检测稀释倍数为10-2)；用紫外分光光度法测定用TD-PCR检测三种病毒cDNA最低检出浓度分别为：4.775μg/ml,2.360μg/ml,43.273μg/ml。而在该方法的特异性考察中,RV、SV、AstV、Ye菌、LH菌和SE菌均未见特异性条带的扩增。临床标本检测：利用TD-PCR检测NV时,检出率为29.55%(65/220),普通PCR为25%(55/220), McNemar检验x2=8.1,P=0.002；EV71检出率为34.25%(25/73),普通PCR为24.66%(18/73),χ2=5.14, P=0.016; CoxA16检出率为46.58%(34/73),普通PCR为27.40%(20/73),χ2=10.89, P=0.001。TD-PCR检出率高于普通PCR。8.利用所设计的TD-PCR反应体系,配合特异性引物,本研究从哨点医院普通腹泻病人粪便标本中检测到EV71阳性3例,CoxA16阳性l例。结论：1.根据哨点医院监测四种病毒的情况：RV阳性104例,NV阳性28例,EV7l阳性3例,CoxA16阳性1例,病毒间有交叉感染情况。三者阳性检出者年龄主要都集中在3岁以下,检出率在不同年龄组、性别组之间差异无统计学意义。RV检出率高峰在8月和11月,NV高峰在8月,EV71在11月和12月检测到的,而CoxA16是在2011年2月检测到的。2.RV或(和)NV检出组与均未检出组,两组腹泻病人在基本人口学信息(如年龄、性别、家长职业、家长文化程度、患者文化程度),粪便性状和颜色,临床表现以及流行病学接触史方面差异无统计学意义。但在就诊时间、患者职业构成以及呕吐情况方面,两组差异有统计学意义。3.本研究设计的TD-PCR方法能针对一份粪便标本、仅用一台PCR仪同时快速检测NV、EV71和CoxA16病毒,大大提高了试验效率,并且用普通Taq酶就可以得到理想实验结果,费用低廉。同时该方法灵敏度和特异性好,比较适用于基层大样本的检测。4.从普通腹泻患儿粪便标本中检测到EV71和CoxA16病毒,但这些病人没有腹泻以外的症状,提示这两种病毒含量较少时可能仅表现为腹泻。