油茶(Camellia oleifera)是我国特有的木本食用油料树种,广泛分布于我国南方14个省份(市、自治区)。炭疽属(Colletotrichum)真菌能够侵染油茶树导致落叶、落花、落果,造成巨大经济损失。本文对湖南、江西、广西、湖北、福建、海南、江苏、重庆、云南、贵州等10个省份的油茶炭疽病进行病原种类鉴定、群体遗传学分析,关键致病基因功能研究,阐明油茶炭疽病原菌的遗传变异规律和致病的分子机理,为油茶炭疽病的防治提供理论依据。研究的主要结果如下:(1)中国油茶炭疽病病原种类鉴定。从全国10个省份采样地总共分离获得406株炭疽属真菌,致病性测试表明这406株菌均能对油茶嫩叶和果实致病,但不同的菌株发病时间具有一定的差异;进一步根据形态特征及6个基因序列(ITS、CAL、GAPDH、ACT、GS和TUB)系统发育分析,最终确定引起全国油茶炭疽病的病原共有6种,分别是果生炭疽菌Colletotrichum fructicola、暹罗炭疽菌 C.siamense、胶孢炭疽菌 C.gloeosporoides、山茶炭疽菌C.camelliae.哈锐炭疽菌C.horii和一种疑似新种;其中C.fructicola分布范围最广,分离率最高,达到71%。5种已知病菌之间的分生孢子产生率差异显著(P<0.01)。(2)果生炭疽菌C.fructicola的群体遗传学和流行病学研究。分析了分离至全国7个省份15个油茶样地167株果生炭疽菌,4个基因(转录间隔区(internal transcribed spacers ITS;539 bp)、钙调蛋白基因(calmodulin CAL;633bp)、谷氨酰胺合成酶基因(glutamine synthetase GS;711 bp)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH;190bp)的单核苷酸多态位点含量分别是3.52%、0.63%、8.44%和7.89%,推导出15、5、12和11种等位基因。综合分析样品的四个位点的不同等位基因,推导出所有样品总共53种基因型,其中有一种基因型出现频率非常高,有21个菌株,分布在3个省份的8个油茶样地,说明该病菌具备长距离无性扩散的能力。此外,我们也检测到了病菌在不同地理群体间统计上具有显著意义的具有遗传分化现象。另外,虽然没有证据表明在四个基因片段中的同一个基因内发生过重组事件,但是我们发现该菌在不同地理群体中,四个基因片段之间具有明显的有性繁殖现象。(3)油茶及其它不同寄主植物果生炭疽菌群体遗传学分析。从海南四个地区9种不同寄主植物中总共分离获得12个种群的108个C.fructicola病菌样品。根据三个基因序列可推导出18种单倍体型(haplotype),其中单倍型Haplotype11共70个菌株,为优势单倍型,在每个病菌种群中均有分布;单倍型网络结构分析表明,病原菌以单倍型Haplotype11为辐射中心,呈现出一个比较典型星状发散图,推测Haplotype11为原始单倍型;108株病菌表现出丰富的遗传多样性;AMOVA分析显示,种群间和种群内的遗传变异分别占总变异的3%和97%,变异主要存在种群内,而种群间的差异非常小,说明不同的寄主植物未对病菌交流造成隔离障碍;遗传分化和基因流分析发现,12个病菌种群间遗传分化小,种群间基因交流频繁;另外,油茶种群之间以及油茶与鲫鱼胆、葛根和山矾等植物种群之间的果生炭疽菌存在遗传重组现象;系统发育分析表明来自同一个果生炭疽菌种群的单倍型未能聚在一起,而是散乱地分布在系统树中,没有显示出明显的寄主植物分布族群;核苷酸不配对分析表明病菌种群历史上并没有发生过显著的种群扩张。(4)果生炭疽菌MAPK基因CfPMKl功能研究。根据模式菌酿酒酵母Fus3蛋白的氨基酸序列在油茶果生炭疽菌C.fructicola全基因组数据库中进行Blastp分析,获得一个同源基因,命名为CfPMKl。通过同源重组的方式对该基因进行敲除并对突变体进行回补。研究结果表明,CfPMKl基因敲除导致突变体菌丝生长速率下降、产孢量减少,分生孢子及菌丝不能形成附着胞等侵染结构,对细胞壁抑制剂敏感以及不能正常进行有性生殖,突变体丧失对油茶叶片的侵染能力。将CfPMKl基因回补到稻瘟病菌Magnaporthe oryzae的PMKl基因缺失突变体中,其表型和致病性均能恢复,说明该类基因在真菌中比较保守。综上所述,中国油茶炭疽病的病原菌种类复杂多样,果生炭疽菌是主要病原种类;自然界中,果生炭疽菌具有无性和有性两种繁殖方式,不同的地理种群遗传分化显著;该菌在油茶与其它寄主植物之间存在广泛的基因交流现象;果生炭疽菌MAPK基因CfPMKl基因参与调控病菌生长、产孢以及致病性。