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筛选性能优良的纤维素酶组分和建立高效分泌纤维素酶的表达系统对于木质纤维素的利用和生物炼制行业成本的降低非常重要。构建分泌纤维素酶的重组菌有很多的优势,比如产酶营养需求低,便于在分子水平上对产酶基因进行表达调控等。
本研究首先借助Escherichia coli BL21(DE3)/pET-28a(+)表达系统,筛选了来自热纤梭菌(Clostridium thermocellum),解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum)和野油菜黄单孢菌(Xanthomonas campestris pv. campestris)的近20种细菌纤维素外切酶基因,比较了其外切酶的酶活。同时为了实现纤维素酶的胞外分泌表达,建立了枯草杆菌表达系统Bacillus subtilis WB600(WB800)/pP43JM2,随后将来源于热纤梭菌的外切葡聚糖酶CbhA,CelK,Ce148S,Ce148Y,CelO和内切葡聚糖CelA以及欧文氏菌(Erwinia carotovorasubsp.)的内切葡聚糖酶CelV,嗜热放线菌(Thermomonospora fusca)的内切酶CelE在枯草杆菌表达系统里进行了表达。实验结果表明,除了外切酶CelO外,其它四种纤维素外切酶和三种不同来源的纤维素内切酶在枯草杆菌WB600和WB800中都实现了成功的分泌型表达,以磷酸处理的微晶纤维素为底物,外切酶在枯草杆菌WB800表达系统中的酶活要普遍高于相应的WB600的酶活,外切酶CbhA释放的还原糖的量可以达到300mg/L,而WB600分泌的内切酶CelA释放的还原糖可以高达1250mg/L。对于微晶纤维素和稀酸处理的秸秆等结晶度较高的底物,外切酶CbhA和内切酶CelA呈现良好的协同作用。在枯草杆菌里表达纤维素酶为实现纤维素酶多组分的人工组装以及枯草杆菌整合生物工艺菌种的构建奠定了基础。