PflhDCSTM碱基突变对其在大肠杆菌中转录活性的影响

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细菌鞭毛的生物合成,组装和旋转需要大量的资源和能量,为了避免不必要的能量消耗,鞭毛进化出了一套高度有序的表达调控系统,其中flhDC基因是整个鞭毛系统的主调控基因。flhDC基因受多种环境因素的调控,有一系列的正调控或负调控因子调控flhDC基因的表达。为研究flhDC基因的表达调控,实验室前期从鼠伤寒沙门氏菌CVCC542中扩增了不同长度的flhDC基因启动子片段(pflhDCSTM),本研究首先将不同长度pflhDCSTM克隆于含lacZ报告基因的载体中,转化至沙门氏菌CVCC542和大肠杆菌JM109感受态细胞,采用β-半乳糖苷酶试验测定不同长度pflhDCSTM在CVCC542和JM109菌株中的转录活性,结果发现pflhDCSTM在CVCC542和JM109菌株中具有相似的转录活性。为进一步研究pflhDCSTM在JM109菌株中的转录调控,本研究采用易错PCR的方法对pflhDCSTM引入随机突变,并将突变的pflhDCSTM克隆于报告载体中,转化至JM109感受态,获得含突变pflhDCSTM的JM109重组菌株。然后结合β-半乳糖苷酶试验筛选活性升高的克隆,并对这些克隆进行测序,获得了这些高活性克隆的碱基突变位点。此外,本研究还通过人工定点突变,对其中部分突变位点进行了验证,证实了-200和-242处的点突变会导致pflhDCSTM在大肠杆菌中转录活性的升高。  综上,本研究获得了一系列能够使pflhDCSTM在大肠杆菌中转录活性升高的碱基突变位点,为研究flhDC基因的表达调控和探索flhDC基因的转录因子提供了一定的基础。
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