随着奶业的加速发展,牛奶的质量越来越受到社会的广泛关注,乳脂肪含量是衡量牛奶品质的重要指标之一。中国荷斯坦奶牛是中国数量最多、分布最广、产乳量最高的奶牛品种,但其产生的牛奶中乳脂肪含量偏低。奶牛瘤胃中植物细胞壁多糖降解后生成的乳脂前体物乙酸和丁酸是乳腺中主要的生脂活力来源,对提高乳脂肪含量具有重要作用。将植物细胞壁多糖转化为乙酸和丁酸涉及许多过程,首先是植物细胞壁多糖降解为单糖的过程,然后是单糖发酵生成乙酰辅酶A的过程,而后是乙酰辅酶A作为底物在不同酶催化下生成乙酸和丁酸的过程,这些过程由瘤胃微生物完成。目前,对于瘤胃微生物在这些过程中的真实作用,尚不是很清楚,有必要利用宏转录组学技术对瘤胃微生物进行研究。本研究通过改进奶牛瘤胃样品总RNA提取方法,获得了中国荷斯坦奶牛6个瘤胃样品中高质量的总RNA。先用试剂盒去除总RNA中的核糖体RNA,而后利用Roche GS FLX对饲喂后的5个样进行测序,采用HiSeq 2000对饲喂前的1个样进行测序。对原始测序数据前处理以及去除核糖体序列后,总计获得1.2G的高质量非核糖体序列。宏转录组分析结果显示,瘤胃中约30%的非核糖体序列在NR数据库中没有同源基因,是未知的新序列,另70%具有同源基因的非核糖体序列称之为已知功能基因转录本。分析已知功能基因转录本物种来源,结果显示,分别有75-92%、2-5%、0.7-1.6%和2-12%来源于细菌、古菌、真菌和原虫。瘤胃细菌转录本来源于705个属,丰度最高的属有瘤胃球菌属(8-14%)、梭菌属(8-12%)、丁酸弧菌属(3-6%)、真杆菌属(3-6%)、普氏菌属(7-13%)和拟杆菌属(1-5%)。瘤胃古菌转录本来源于42个属,优势属有甲烷短杆菌属(71-85%)、Methanosphaera (6-12%)和甲烷杆菌属(1-2%)。瘤胃厌氧真菌转录本来源于76个属,拥有厌氧真菌转录本最多的属有酵母属(1-20%)、新美鞭菌属(2-11%)、梨囊鞭菌属(1-10%)和蛙壶菌属(2-14%)。瘤胃原虫转录本来源于52个属,主要来源于内毛虫属(7-19%)、四膜虫属(5-33%)、小爪虫属(3-10%)、草履虫属(5-18%)、尖毛虫属(0.5-22%)、毛滴虫属(2-7%)、利什曼原虫属(0.3-8%)、疟原虫属(约3%)、内阿米巴属(3-16%)和网柄菌属(2-6%)。饲喂玉米秸秆晨饲1小时后取样的2头中国荷斯坦奶牛瘤胃宏转录组结果显示,在植物细胞壁多糖降解为单糖的代谢中,GH5、GH9、GH45和GH48家族在纤维素降解过程中发挥着主要作用,且主要来源于瘤胃球菌属和纤维杆菌属；GH10、GH11和GH26家族在半纤维素降解过程中发挥着主要作用,主要由瘤胃球菌属、普氏菌属和纤维杆菌属编码；GH1、GH2、GH3和GH43家族在寡糖降解过程中发挥着主要作用,编码它们的微生物种类明显多于编码纤维素酶和半纤维酶的。值得注意的是,GH45和GH48在宏基因组数据很少被检测到,说明它们在纤维素降解过程中发挥着非常重要的作用。宏转录组结果显示,纤维小体在植物细胞壁降解过程中也发挥着重要作用。本研究提供了宏转录组的证据,支持瘤胃球菌属、纤维杆菌属和普氏菌属是主要的植物细胞壁多糖降解菌这一观点,同时指出GH48纤维二糖水解酶和纤维小体结构在奶牛瘤胃高效降解植物细胞壁多糖中具有重大贡献。另外,瘤胃厌氧真菌中的新美鞭菌属、梨囊鞭菌属和根囊鞭菌属以及纤毛原虫中的前毛虫属和多甲多泡毛虫属在纤维素和半纤维素降解过程中也发挥着重要作用。在每一个瘤胃宏转录组数据中均找到3条以乙酰辅酶A为底物生成乙酸的途径——PTA-ACK、ACS(ADP)和ACH途径。其中,PTA-ACK途径是瘤胃中乙酸生成的主要途径,众多瘤胃微生物参与了通过PTA-ACK途径生成乙酸这一过程,发挥主要作用的有梭菌属、瘤胃球菌属、真杆菌属、丁酸弧菌属、普氏菌属、拟杆菌属和螺旋体属。而利用ACS(ADP)途径和ACH途径的瘤胃微生物相对比较单一,厌氧绳菌属和甲烷短杆菌属在ACS(ADP)途径中发挥主要作用,考拉杆菌属在ACH途径中发挥主要作用。结果显示,这3条乙酸生成途径在同一个微生物中不共存。另外,瘤胃中还存在以C02作为末端电子受体生成乙酸的FTHFS途径,梭菌属、Blautia、瘤胃球菌属在这个途径中发挥着主要作用,大量目前尚未分类的未培养菌也参与了该途径。宏转录组结果显示,以乙酰辅酶A为底物生成丁酸的PTB-BK、BCACT和BCAACT途径在瘤胃中均存在。丁酸弧菌属、梭菌属、普氏菌属、Alloprevotella和拟杆菌属是PTB-BK途径中主要的丁酸产生菌,而BCACT途径和BCAACT途径是以Flavonifractor和[Eubacterium] infirmum为主。本研究从宏转录组水平阐释了瘤胃微生物种类、丰度以及作用,丰富了瘤胃微生物资源数据库,为瘤胃微生物的开发利用提供重要的指导。通过瘤胃宏转录组的研究,全面了解了瘤胃微生物在将植物细胞壁多糖转化为乳脂肪前体物乙酸和丁酸这个复杂代谢中的2个限速过程——植物细胞壁多糖降解为单糖和乙酰辅酶A为底物生成乳脂肪前体物乙酸和丁酸——中发挥的作用及真实贡献,为乳脂品质调控提供科学的指导。同时,该研究揭开了瘤胃微生物高效降解植物细胞壁多糖的黑匣子,为可再生资源纤维素和半纤维素的开发利用提供有意义的指导。