用于餐厨垃圾降解的纤维素酶EGIII的克隆与表达研究

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绿色木霉产生的纤维素酶可以降解纤维素,纤维素酶是一种能分解纤维素产生葡萄糖的复合酶的统称,主要包括内切葡聚糖酶(endo-glucanase),纤维二糖水解酶(cellobihydrolase)和β-葡萄糖苷酶(β-1,4-glueosidase),这三种酶协同作用将纤维素转化成葡萄糖。内切葡聚糖酶主要作用于非结晶纤维素和一些可溶性的底物如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素,随机地水解纤维素链内β—葡萄糖苷键使其粘度迅速下降即还原性基团增多,并产生葡萄糖、纤维二糖和各种不同大小的短链纤维葡聚糖。本研究采用分子生物学手段构建了能够高效降解餐厨垃圾纤维素基因工程菌。研究结果如下:1.采用CTAB法提取绿色木霉的DNA,以T.viride DNA为模板,经过PCR获得目的基因片段;经过琼脂糖凝胶电泳,PCR产物纯化,连接克隆载体,转化大肠杆菌,提取转化质粒,并对其进行单酶切和双酶切验证,确定葡聚糖内切酶EGⅢ在大肠杆菌成功得到表达,成功获得目的基因片段。2.对该基因片段的酶切位点、基因的基因特性、氨基酸、核苷酸和密码子进行生物信息学分析,结果表明:用116种酶屏蔽找到了44个识别位点;全长序列长1849bp,编码616个氨基酸。3.重组毕赤酵母表达产物进行SDS-PAGE分析和酶活性研究证明,内切葡聚糖酶能有效分泌和高效表达,培养液中酶活最高达到681U/mL,得到约61KDa大小的蛋白表达条带,表达产物具有正常的生物学活性,与天然的内切葡聚糖酶性质基本一致。4.通过设置不同梯度诱导时间、接种量和pH值来探讨重组酵母优化表达条件。最佳诱导时间为60h,此时酶活最高值为530U/mL;起始接种量选择OD600=4的时候最合理;pH=5.8的的情况下,毕赤酵母有自行调节的能力。
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