乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）引起的急、慢性肝炎给人类健康带来了严重的威胁，目前全球范围内约有4亿人感染 HBV，每年约有100万人死于HBV感染相关的肝脏疾病。乙型肝炎表面抗原（HBsAg）由乙肝病毒大蛋白（LHBs）、中蛋白（MHBs）和主蛋白（SHBs）三种被膜糖蛋白组成，前S1蛋白（preS1）位于 LHBs的N末端并暴露在LHBs的表面，该区域被证实与HBV的侵袭密切相关。PreS1不仅是监测 HBV 感染的重要标志物，而且在动物实验中证实，应用抗体阻断该区域能够有效保护恒河猴免于 HBV 感染。在我们前期的工作中，通过用 preS1(aa91-107)肽段免疫Balb/c小鼠，获得了一株特异性针对preS1的鼠单克隆抗体（mAb-D8）。为了提高该株抗体亲和力，我们克隆了mAb-D8的可变区基因，并通过同源建模构和分子对接等生物信息学技术构建了 ScFvD8-preS1(aa91-107)复合物的三维结构。运用 FoldX等软件预测分析，通过定点突变，将轻链第96位Tyr和重链第98位Asp突变成Ser后，单链抗体ScFvD8的亲和力提高了10倍。在此基础上，根据邻位触原理（PDHS）设计了高灵敏的preS1检测电化学免疫传感器，该免疫传感器的线性检测范围为1pM到 50pM，检测下限为 0.1pM。在临床血清样品检测中它的的灵敏度和特异性分别为100％和 96％，表明该传感器在 preS1 临床快速检测中有潜在的应用价值。同时，为了获得针对preS1的全人源抗体，我们构建了一个基于Cre-Loxp重组系统全人源噬菌体抗体库，该抗体库的库容为 1011，经过 4 轮淘选，鉴定 1000 个克隆，最后获得 4株特异性抗preS1全人源抗体，为下一步HBV预防药物的研发奠定了工作基础。　　主要研究内容和结果:　　1. mAb-D8可变区基因的克隆和单链抗体表达　　应用噬菌体展示等技术克隆mAb-D8的轻、重链可变区序列，通过一个(G4S1)4短肽连接轻、重链可变区基因，获得一株亲和力约50nM的抗preS1 单链抗体（ScFvD8）。然后分别构建了ScFvD8在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达载体pET28a-SUMO-ScFvD8及真核细胞 CHO-S 中的表达载体 pcDNA3.4-ScFvD8，其在原核、真核表达量分别达到了100mg/L、40mg/L。　　2. 计算机辅助设计指导ScFvD8体外亲和力成熟　　通过同源建模、分子对接等生物信息学手段构建了preS1(aa91-107)肽段与ScFvD8相互作用的3D模型，通过模型可以观测到ScFvD8与preS1(aa91-107)肽段结合的关键位点由轻链上的 Lys53、Tyr32、Thr92 和重链上的 Ser56、Tyr97、Ser31 构成。应用FoldX等软件预测分析，将ScFvD8的两个位点L96Tyr和H98Asp分别突变成Ser之后，获得一株亲和力提高10倍的突变体单链抗体ScFvD8-M。　　3. preS1电化学检测免疫传感器的构建与性能鉴定　　根据邻位触及DNA杂交原理，设计了preS1检测电化学免疫传感器。首先，用金纳米颗粒（AuNPs）修饰打磨合格的玻碳电极，以捕获 DNA（Capture Linker）通过5端的-SH基和电极表面上的AuNP之间以S-Au共价键结合，将Capture Linker修饰到电极表面上。二茂铁（Fc）修饰的竞争DNA（Competitor DNA）可以与Capture Linker杂交，Fc在电极表面上的电化学氧化还原反应会产生清晰的Fc电化学信号。当preS1重组蛋白和ScFvD8-M之间发生了特异的抗原抗体反应而结合的时候，基于邻位杂交原理，形成的复合体DNA-Ag-Ab-DNA可以与Associated DNA杂交，进一步可以竞争性地与CaptureLinker结合，导致Fc修饰的Competitor DNA结合在Capture Linker上的量减少，引起Fc信号的降低。当样品中存在游离的preS1抗原情况下，它可以与Ab-DNA反应，减少复合体DNA-Ag-Ab-DNA的形成。DNA-Ag-Ab-DNA复合物的形成的量取决于样品中游离的 preS1 抗原浓度，基于此原理即可定量检测溶液中 preS1的浓度。　　优化了传感器检测实验条件，确定 DNA 杂交时最佳浓度、温度和缓冲液最适合的Mg2+浓度分别为50nM、35℃、0.4M。通过检测系列浓度preS1抗原，确定该传感器的线性检测范围为1pM到50pM，检测下限为0.1pM。在5种不同干扰物存在的情况下，检测到的电位值与仅存在 preS1 重组蛋白时的情况下无显著性差异，表明该免疫传感器具有优异的选择性。取不同时间、不同批次制备的免疫传感器，发现不同批次间的结果变异小于4%。不同批次的传感器在4℃条件下分别储存2周，2周后不同批次制备的传感器平均能保持 92.21％初始电位值，表明该传感器具有良好的重复性和稳定性。在临床血清样品检测中该传感器的灵敏度和特异性分别为100％和96％，表明该免疫传感器具有应用于临床的潜在价值。　　4. 基于Cre-Loxp重组系统全人源噬菌体抗体库的构建　　收集了健康成人外周血标本400人份、骨髓血标本20人份、脐带血10人份，分别分离淋巴细胞，共提取约100μg RNA，逆转录成cDNA，应用49对引物分别扩增抗体的VH、VL基因，通过延伸引物再次PCR为第一次PCR抗体基因添加Loxp连接肽，重叠PCR拼接VH、VL基因，经酶切、连接将抗体基因ScFv插入到噬菌粒载体pDF，电转大肠杆菌OMNImax构建ScFv形式初级抗体库。分别获得一个库容为5 ×107外周血及脐带血来源的初级抗体库和一个库容为5×107骨髓来源的初级抗体库。通过优化重组条件，初级库侵染表达Cre酶的BS1365菌株，经过Cre-Loxp酶介导的轻重链置换重组，获得一个库容为1011的重组抗体库。　　5.HBV preS1全人源抗体的筛选及初步验证　　原核表达preS1抗原及合成preS1(aa91-107)肽段，经过4轮富集筛选，鉴定1000株克隆，获得4株特异性针对preS1的全人源ScFv抗体。