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RNA原位杂交不仅可以帮我们观察细胞中转录本的三维空间结构、探索不同RNA的转录机制和分布规律、还可用于感染性疾病和肿瘤的临床诊断和疗效监测,甚至是“金标准”。目前常用的RNA原位核酸显影可以分为明场可见光条件下的化学发光显色和荧光显色,也就是RNA原位杂交(RNA in situ hybridization,RNA ISH)和RNA荧光原位杂交。但前者通常使用的酶化学反应会导致显影物质在生成后扩散沉积,导致核酸定位弥散且不准确。后者虽然定位准确且分辨率高,但需要特制荧光探针、价格昂贵,杂交过程复杂,费时费力。直到2012年美国加州大学伯克利分校杜德娜教授首次报道CRISPR/Cas9的基因靶向编辑功能后,其原位显影检测方面的应用也得到了逐渐开发,显示出较大的应用潜力。当前基于CRISPR的基因组标记主要依赖于使荧光标记的dCas9蛋白和单链引导RNA(single guide RNA,sgRNA)形成二元复合物,利用该复合物sgRNA上的spacer序列识别并特异性结合靶序列从而使其显影。RNA标记则在此基础上引入一条 2’-OMe 修饰的外源寡核苷酸链(PAM-presenting oligonucleotides,PAMmer),使其代替PAM引导dCas9/sgRNA复合物识别RNA靶序列从而实现特定RNA分子的荧光标记。这种策略简便、快速且特异性好,正好弥补了当前RNAFISH方法的不足。但该CRISPR/dCas9原位杂交方法的信号往往较弱,只能用于高丰度转录本的显影且无法适用于固定细胞,因此无法满足临床样本检测的需求。因此,为了解决上述现有CRISPR介导RNA原位标记方法所存在的问题使其更具临床转化应用价值,本研究将体外转录包含多个MS2寡核苷酸适配子的sgRNA与纯化得到的dCas9和荧光标记的MS2衣壳蛋白(MS2 coat protein,MCP)连同PAMmer序列在体外组装成复合探针共同孵育固定组织和细胞,成功研发了一种CRISPR介导的能够用于固定组织细胞且方便易用、灵敏高效的单分子RNA原位标记方法:RCasFISH,以满足RNA胞内定位的临床诊断需求。目前用于评价乳腺癌HER2的检测手段主要包括DNA FISH和免疫组织化学技术。FISH的实验过程需要变性,不仅操作繁琐耗时、价格昂贵且有约5%的样本无法最终定性;免疫组织化学对抗体的亲和力要求较高、需要有经验的医师进行判读且结果判断较为主观。临床乳腺癌HER2的判定需要一种简便快速、灵敏准确、经济客观的检测手段。由于绝大多数乳腺癌样本HER2mRNA的与DNA的扩增水平呈正相关,因此可以使用mRNA水平进行HER2状态的辅助判断。在本研究中,我们首先在体外表达纯化了 dCas9和MCP融合蛋白,转录了用于信号放大的3’末端含有多个MS2串联重复序列的sgRNA,最终合成靶向HER2 mRNA所需RCasFISH显影系统的各个组分,之后将其用于不同乳腺癌细胞系HER2mRNA的原位显影。为了评价该系统的检测性能,我们对RCasFISH的标记效率、定量能力、信噪比、灵敏度、特异性、精密度、假阳性率进行了验证并与单分子RNA原位杂交smFISH和RNAscope进行了方法学对比。随后本研究分别对小鼠异体移植瘤和乳腺癌患者福尔马林固定石蜡包埋样本中的HER2 mRNA进行原位定量检测以验证RCasFISH的临床适用性。结果显示,RCasFISH能够有效标记固定组织和细胞中的HER2mRNA及拷贝数在10以下的低丰度RNA转录本。该显影系统对两个及以上碱基突变敏感,标记效率>85%,实验结果拥有良好的信噪比和重复性,批内变异系数小于6.1%。除此之外,RCasFISH可以对细胞内包括低丰度mRNA在内的转录本水平进行单分子定量,计量结果与qRT-PCR结果相近且呈线性相关(r=0.9259)。相比smFISH和RNAscope这两种被广泛使用的单分子RNA原位杂交手段,RCasFISH显示出较高的信噪比和简易省时的特点。此外,在包括43例阳性、37例阴性、2例无法判定HER2状态的共计82例临床乳腺癌队列样本中,RCasFISH的诊断结果与FISH和免疫组织化学结果的一致率为94.5%,检测灵敏度为93.5%,特异性为95.8%,阳性预测值为96.7%,阴性预测值为92.0%,显示出较好的检验效能。值得注意的是,RCasFISH能够对FISH和免疫组织化学定义的“HER2状态无法判定”的乳腺癌样本进行辅助诊断,具有重要的临床分子诊断价值。综上所述,本研究首次成功研发了一种基于CRISPR信号放大系统的单分子RNA原位成像工具。与其他现有的RNA原位检测方法相比,该系统具有简便易用、成本低廉、灵敏高效的特点。关键的是,该系统可以实现固定细胞和组织RNA转录本的定位检测和定量分析,能够辅助临床进行FISH无法判定样本的快速核酸诊断,为传统的RNA原位杂交方法或免疫组化提供了一种切实可行的替代方案,也为其他领域如基因组融合基因转录本及非编码RNA的原位检测转化应用提供了全新的思路和方法。