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RNA干扰(RNAi)对于基因表达的调控的作用在近几年被揭示,miRNAs(microRNAs)和 endo-siRNAs(endogenous small interfering RNAs)在这个过程中扮演着至关重要的角色。MiRNAs与endo-siRNAs大小相似,不容易被区分,但他们的发生过程是不同的。MiRNAs的形成不仅需要DICER,也需要DROSHA和它的协同因子DiGeorge syndrome critical region 8(DGCR8);而 endo-siRNAs 的形成则只需要DICER。目前,一些研究已经证实是endo-siRNAs而不是miRNAs对小鼠卵母细胞的成熟起显著作用。但是这个研究结果只在小鼠中被证明了,在其他物种中则还尚未有人研究。猪在生理结构、形态学和免疫学上与人有着许多相似的特性,因此猪在人类疾病临床研究中常被作为动物疾病模型。据此,本研究主要关注miRNAs和endo-siRNAs对猪卵母细胞体外成熟的影响。本实验首先通过显微注射法将LNA-DICER1,LNA-DROSHA和LNA-DGCR8注入生发泡(GV,Germinalvesicle)期的卵母细胞内,对DICER1,DROSHA和DGCR8进行敲减,再经过体外成熟培养,通过检测第一极体的排出以及免疫荧光的方法检测miRNAs和endo-siRNAs的缺失对卵母细胞体外成熟以及染色体、纺锤体形态的影响。结果显示:(1)与对照组相比,只有显微注射了 LNA-DICER1的卵母细胞成熟率显著下降,从75.20%下降到 39.23%(p<0.05);而注射了 LNA-DROSHA组和 LNA-DGCR8组的卵母细胞成熟率无明显变化,分别是68.71%和71.25%。(2)与对照组相比,显微注射了LNA-DICER1组的卵母细胞染色体与纺锤体形态均异常,散乱无序;而显微注射了LNA-DROSHA组和LNA-DGCR8组的卵母细胞染色体与纺锤体形态均正常。表明DICER1的缺失,而不是DROSHA和DGCR8导致了猪卵母细胞成熟的失败。接下来,本研究通过Annexin-V法和Western Blot检测了DICER 敲减对猪卵母细胞凋亡的影响。结果显示,DICER1敲减后,卵母细胞中外翻的磷酯酰丝氨酸阳性信号变多,p53的表达量也有明显升高,表明DICER1的缺失会导致猪卵母细胞的凋亡,暗示endo-siRNAs对猪卵母细胞体外成熟有重要影响。最后,抑制DICER1的正常表达后,我们通过生物信息学测序分析了卵母细胞中小RNA的表达情况。实验结果表明显微注射LNA-DICER1后长度为22～24 nt的小RNA表达量明显降低。于是我们对敲减DICER1前后的卵母细胞中的小RNA进行了分类鉴定,发现在DICER1表达量降低后,只有miRNA和endo-siRNA的总序列数发生了明显的降低。进一步分析了敲减DICER1前后的卵母细胞中的endo-siRNA的表达量变化之后,我们发现的DICER1缺失会导致endo-siRNA表达量的降低。综上,本研究明确了DICER1,DROSHA和DGCR8对猪卵母细胞成熟及凋亡的影响,证明了 endo-siRNAs而不是miRNAs的缺失导致了猪卵母细胞成熟的异常以及凋亡。研究结果为深入解析endo-siRNAs对猪卵母细胞成熟的具体调控机制提供了理论依据。