基于CRISPR/Cas13a与脂质体辅助放大磁弛豫传感信号直接检测miRNA和致病菌

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癌症和感染性疾病严重威胁人类健康。研究表明,通过控制micro RNA(mi RNA)表达水平来促进肿瘤生长、侵袭、血管生成和免疫逃避。因此,mi RNA是肿瘤诊疗和预后的潜在重要指标,对其进行快速准确的检测具有积极意义。致病菌如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)等是引起败血症、肺炎、心内膜炎等各种感染性疾病重要成因,对其进行灵敏快速检测具有重要的临床研究与实践意义。复杂生物样本由于组分繁多通常具有较多的背景干扰信号,使得比色、荧光、电化学等方法在进行复杂样本中目标物直接快速检测分析中表现出不足。因此发展快速准确检测复杂生物样本(如血液等)中目标物(如mi RNA和致病菌)的方法,对癌症和感染性疾病诊断及治疗具有重大意义。磁弛豫传感(Magnetic relaxation switching,MRS)通过改变水质子的弛豫时间来定量分析待测物质的浓度,其分析信号为磁弛豫时间,不依赖于光信号,无需对样本进行分离和纯化即可直接分析,简单方便、无损、抗干扰能力强。本论文基于CRISPR/Cas13a、脂质体等策略增强磁弛豫传感信号进行复杂生物样本中mi RNA和致病菌灵敏、准确直接检测。第一部分:基于CRISPR/Cas13a增强Fe3O4磁弛豫传感信号检测mi RNA。以羧基化的尺寸30nm Fe3O4磁性粒子(MB30)和链霉亲和素功能化的尺寸1000nm磁性微球(MM1000)共修饰RNA1构建信号探针(MB30-RNA1-MM1000),CRISPR/Cas13a系统中cr RNA(CRISPR RNA,cr RNA)特异性识别mi RNA-21(mi R-21),触发酶激活反应,剪切信号探针(MM1000-RNA1-MB30)中RNA1,释放MB30。经磁分离测样本中游离MB30的磁弛豫信号(T2),从而实现对mi R-21的定量检测。研究表明,该方法用于mi R-21的检测范围:1 p M-50 n M,线性方程为:y=142.25x+33.69,R~2=0.9930检测限:0.22 p M;非靶标mi RNA-15(mi R-15)、单碱基错配mi R-21(Smi R-21)、双碱基错配mi R-21(Dmi R-21)不干扰检测信号。进一步研究表明,该策略可成功应用于血清样本中mi RNA的直接分析,且与实时荧光定量PCR(real-time quantitative,q RT-PCR)测定的结果相比更接近真实值。第二部分:基于脂质体增强Fe2+/Fe3+磁弛豫传感信号检测金黄色葡萄球菌。该研究以万古霉素(Vancomycin,Van)修饰的磁珠(MB200-Van)和生物素化-免疫球蛋白(Biotin-Immunoglobulin,Biotin-Ig G)作为识别探针通过夹心方式去捕获金葡菌。装载葡萄糖分子(Glucose,Glu)的生物素化-脂质体(Biotin-Liposome@Glu)通过与链霉亲和素(Streptavidin,SA)亲和作用标记金葡菌后,在1%的聚乙二醇辛基苯基醚(Triton-X-100)下作用释放葡萄糖。与葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase,Gox)作用产生过氧化氢(Hydrogen peroxide,H2O2),氧化Fe2+成Fe3+,引起磁弛豫信号变化。通过T2变化值(ΔT2)分析样品中金葡菌的含量。研究结果表明,该方法对金葡菌的检测范围为:10^2-10^7cfu.m L-1,检测限为:10^2cfu.m L-1。该策略联合MRS和脂质体信号放大,成功用于全血样本中致病菌的检测。
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