目的：1．研究探讨未刺激周期未成熟卵体外成熟／体外受精—胚胎移植技术(IVM／IVF-ET)在治疗多囊卵巢综合征不孕治疗中的应用，并探讨影响IVM治疗成功率的因素。2．本课题通过研究体外成熟培养后卵子发育潜能与卵丘颗粒细胞凋亡之间的关系，旨在能够预测卵母细胞体外发育潜能，并指导临床选择优质胚胎进行移植，提高移植成功率。3．探讨体外培养中人卵母细胞形态学评价与人卵母细胞体外发育潜能的关系及超微结构的变化规律。材料与方法：1．选取有胰岛素抵抗(IR)的PCOS患者48例，进行IVM／IVF-ET治疗，其中随机选取24例在TVM治疗前服二甲双胍进行预治疗3个月，另24例直接进行IVMIVF-ET治疗，共92个周期，作为治疗组。同时期接受ICSI-ET的非PCOS患者共73例98个周期作为对照组。所有患者均测定基础性激素水平，OGTT及5次INS水平，ELISA法测定血清卵泡液中IGF-1、IGFBP-1以及瘦素水平。统计获卵数、成熟卵数、受精卵数、卵裂数、优质胚胎数、移植周期数，并对各组临床资料进行统计学分析。2．标本来源于2006年1月～4月就诊于沈阳204医院生殖医学中心的多囊卵巢综合征患者，采用B超引导下经阴道穿刺取卵，获得的未成熟卵子经体外培养32小时后对卵行胞浆内单精子显微注射(intracytoplasmic sperm injectionICSI)，在显微注射受精前对卵进行消化脱去颗粒细胞，将这些颗粒细胞分别收集起来，用TUNEL方法进行染色，用光镜进行观察，记数每一标本的颗粒细胞的凋亡率，并与卵子的成熟情况和卵子质量评分及发育成的胚胎评分做比较。3．运用光镜观察体外培养前生发泡期(GV期)、培养后生发泡破裂但仍处于MⅠ期的未成熟卵母细胞和达到MⅡ期的成熟卵母细胞的形态，并将卵母细胞分为优质与非优质，同时观察颗粒细胞发育情况，并与卵母细胞体外发育潜能进行比较；用透射电镜观察卵母细胞的超微结构，总结其变化规律。实验结果：1．IVM／IVF-ET组与常规ICSI组相比成熟卵率(71.0％；86.9％)、受精卵率(66.1％；80.2％)、卵裂率(52.2％；74.4％)、优质胚胎率(24.4％；54.2％)、临床妊娠率(25.0％；34.7％)均显著下降(P＜0.05)。各影响因素中，只有瘦素水平对IVM成功率有影响(P＜0.05)，瘦素低预测IVM妊娠率高；进行二甲双胍预治疗可以提高IVM的妊娠率(P＜0.05)，对于取卵数、成熟率、受精率和卵裂率没有影响(P＞0.05)。2．本研究共对206个卵母细胞的颗粒细胞进行了凋亡率的观察。在对卵母细胞进行体外成熟培养前，根据其形态学特征进行评分，分别记数不同评分卵子的颗粒细胞的凋亡率，发现随着卵子评分的降低，颗粒细胞凋亡率逐渐升高。其中，0’卵母细胞的颗粒细胞的平均凋亡率与评分为3’和4’的卵母细胞的颗粒细胞的平均凋亡率相比显著增高(P＜0.01)。经体外成熟培养后，随着卵子成熟程度的降低，凋亡率升高，褪变死亡的卵子凋亡率最高。退变死亡的卵母细胞的颗粒细胞的平均凋亡率显著高于获得成熟的MⅡ期卵母细胞(P＜0.01)；对116个经体外成熟培养后达到MⅡ期的卵进行胞浆内单精子显微注射和胚胎培养，对胚胎进行评分，结果发现能受精并且受精后能够形成胚胎的卵的颗粒细胞平均凋亡率明显低于不能受精或受精后不分裂的卵的颗粒细胞平均凋亡率，这说明随着卵子发育潜能的降低，颗粒细胞凋亡率逐渐升高。3．优质卵母细胞与非优质卵母细胞比较，受精率和优质胚胎率均明显增高(P＜0.05)；颗粒细胞(GC)层数代表颗粒细胞的发育情况，GC≥6的卵母细胞卵裂率和优质胚眙率高于GC层数少者，与GC＜3的卵母细胞相比差异有显著性(P＜0.05)。超微结构观察中发现：GV期卵母细胞微绒毛短小稀少；核偏一侧，核仁致密化。培养后卵母细胞微绒毛粗大增多；细胞器丰富，高尔基体周围有许多分泌小泡；线粒体和脂滴伴行；卵丘细胞的胞质突起与卵母细胞的微绒毛间形成缝隙连接，卵丘细胞之间形成较多桥粒。成熟的卵母细胞粗面内质网、高尔基体减少，滑面内质网发达，线粒体幼稚化，脂滴融合，皮质颗粒沿质膜下呈线行排列，细胞连接减少，第一极体含多种细胞器。非优质卵母细胞线粒体大量存在膜和嵴模糊、膨大的现象，有的极体碎裂，透明带形态不正常，其周围卵丘细胞的凋亡率较高。结论：1．未刺激周期IVM／IVF-ET技术对于PCOS患者具有一定的治疗效果，可以应用于临床PCOS患者的不孕治疗，是临床有效治疗PCOS的新途径。各影响因素中，低瘦素水平是预测高IVM成功率的指标，对于有IR的PCOS患者进行二甲双胍预治疗有助于提高IVM成功率。2．卵子发育潜能与颗粒细胞凋亡之间具有密切的关系，可以通过测定颗粒细胞凋亡率来初步预测卵子的发育潜能。并且卵子能否经体外培养达到成熟，以及能否获得优质的胚胎与卵子周围颗粒细胞的功能状态有一定关系。3．通过光学显微镜评价卵母细胞及颗粒细胞形态，并与其发育潜能进行比较发现，卵母细胞形态规则、胞质均匀，有光泽，有一定的卵周间隙，颗粒细胞层数≥3层是具有较好的发育潜能的预测指标。根据此标准预测卵母细胞的发育潜能可以提高胚胎移植着床率，降低多胎妊娠率，指导实验室各项工作。另外，还揭示了体外培养的不同时期、不同质量的人卵母细胞的超微结构。