【摘 要】
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主动免疫催乳素和抑制素可以通过不同的机制影响雌禽的繁殖活动并提高产蛋和繁殖性能,因此在制备抑制禽类就巢的基因工程抗原或疫苗的研究中,选择的思路之一是利用禽类催乳素和
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主动免疫催乳素和抑制素可以通过不同的机制影响雌禽的繁殖活动并提高产蛋和繁殖性能,因此在制备抑制禽类就巢的基因工程抗原或疫苗的研究中,选择的思路之一是利用禽类催乳素和抑制素。亚基片段编码基因序列重组为融合基因,以制备同时包含这两种激素片段的融合蛋白。通过PCR和分子克隆的方法首先将全部粤黄鸡催乳素成熟肽cDNA克隆到载体pRSET A的BglⅡ和EcoRⅠ两克隆位点之间,获得重组质粒pPRL-RSET。家鸡抑制素α亚基片段经扩增后分别被克隆入质粒pRSET A和pPRL-RSET的NheⅠ和XhoI两克隆位点之间,构建成重组质粒pINB-RSET和pINB-PRL。以上重组质粒的构建正确性分别由各特定引物组合扩增的PCR产物长度、特定限制性内切酶消化各重组质粒所得产物长度以及对各质粒的测序结果得到验证。重组质粒pPRL-RSET和pINB-PRL在转化大肠杆菌BL21(DE3)株后经IPTG诱导后所表达的产物经SDS-PAGE显示分别与所预期的重组蛋白分子量大小相符,两种融合蛋白均是不溶性的,主要以包涵体的形式存在。当0.D600在0.6-0.8之间,IPTG终浓度为0.01mmol/L时,诱导2小时pINB-PRL可获得最大的表达量;加入IPTG至终浓度为0.005mmol/L时,诱导4小时pPRL-RSET可获得最大的表达量。质粒pPRL-RSET和pINB-PRL的表达产物和用Ni-NTA凝胶纯化的两重组蛋白产物都与抗鸡催乳素抗体产生特异的免疫印迹,并且表达菌裂解液和相应的纯化蛋白的免疫印迹处于同一位置。以上结果说明成功完成了家鸡催乳素和抑制素α亚基片段重组质粒的构建、蛋白表达和纯化及鉴定工作。
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