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研究目的:本研究以人软骨基质蛋白C末端α-螺旋肽为纳米材料,N端融合RGD肽,组成靶向整合素αvβ3的两亲性肽(P45),在阿霉素的激发下自组装形成载药纳米颗粒(Dox/P45),对其进行表征,考察载药纳米的细胞靶向摄取、pH敏感释放以及体外抗肿瘤活性。研究方法:1.Dox/P45纳米颗粒的制备及表征:以芘作为荧光探针,检测P45的临界胶束浓度(CMC);圆二色谱(CD)分析P45的二级结构;P45与Dox以不同的摩尔比制备纳米颗粒,通过激光散射粒度仪检测粒径、分散性,用紫外分光光度计检测Dox荧光强度,计算包封率和载药率,确定P45与Dox最佳的结合比例;透射电子显微镜(TEM)观察Dox/P45纳米颗粒的形态和大小;激光散射粒度仪检测Dox/P45纳米颗粒粒径、分散性及Zeta电位;透析法检测Dox/P45纳米颗粒体外药物累计释放率;激光粒度仪检测Dox/P45纳米颗粒的体外粒径变化情况以评价其稳定性;合成一系列长度多肽并在不同pH值的缓冲溶液中研究小肽的自组装现象,探讨电荷、RGD残基对肽自组装的影响。2.Dox/P45纳米颗粒的细胞摄取及毒性研究:选取A549、MCF-7、HEK293细胞系为高表达、低表达和阴性表达整合素αvβ3的细胞模型。流式细胞术(FCM)检测三种细胞对Dox/P45纳米颗粒、Dox/P41纳米颗粒以及游离Dox摄取后的细胞数及荧光强度;激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)观察Dox/P45纳米颗粒、Dox/P41纳米颗粒以及游离Dox在细胞内的分布;CCK-8试验检测Dox/P45纳米颗粒、Dox/P41纳米颗粒以及游离Dox对三种细胞活性的影响。研究结果:1.Dox/P45纳米颗粒的制备及表征:测得P45的CMC为1.25mM;P45在208、222 nm有α-螺旋特征吸收峰;按不同的Dox与P45摩尔比(16:1、10:1、8:1、4:1、2:1、1:1)制备纳米颗粒,测得粒径分别为 371.6±8.9、209.3±5.5、167.1±3.3、217.8士7.5、291.8±9.1、279.4±4.5 nm;PDI 分别为 0.223、0.277、0.189、0.208、0.303、0.229;包封率分别为 9.0士2.2%、21.1±1.3%、28.2 士 2.8%、38.6±2.9%、36.8±1.1%、35.9±2.3%;载药率分别为5.2±1.4%、13.8±2.1%、35.1±1.2%、49.2±1.7%、48.6±2.3%、49.0±1.3%;选取最佳配比8:1制得Dox/P45纳米颗粒,其粒径、分散性及Zeta电位分别为167.1±3.3nm、0.189、0mV。TEM结果显示,Dox/P45纳米颗粒为直径大约为63 nm的均一的“桑葚”样球形纳米颗粒;在pH 5.5和pH 6.5的酸性缓冲液中,纳米颗粒Dox在1小时的释放率分别达到了 44.8±1.4%和25.2±1.5%,6h的总累积释放率分别为60.8±2.1%和39.9士1.2%,而在pH7.4的缓冲液中释放极为缓慢,6h累积释放率为5.9±1.4%,差异均具有显著统计学意义(p<0.001);Dox/P45纳米颗粒较为稳定,6h内Dox/P45纳米颗粒粒径波动于167～171 nm之间,粒径变化不超过10 nm;在pH 6.0、pH4.0的P45溶液中加入Dox,结果并未观察到纳米颗粒的形成;将P45的8个氨基酸残基EEDPCACE的电荷区域去除(P32),未观察到纳米颗粒的形成,而保留负电荷区域的P41可形成与Dox/P45类似的纳米颗粒。2.Dox/P45纳米颗粒的细胞摄取及毒性研究:FCM结果显示,Dox/P45纳米颗粒能特异性的富集于A549和MCF-7细胞中,Dox/P41没有明显的靶向作用,而游离Dox在三种细胞系中显示出最强的荧光强度;Dox/P45和Dox/P41纳米颗粒在HEK293细胞没有明显的富集效果;CLSM结果显示,Dox/P45纳米颗粒在A549细胞胞质中呈现较强的红色荧光,在MCF-7细胞中信号较弱,而在HEK293细胞中几乎不显示红色荧光。游离的Dox呈现的红色荧光主要存在于A549、MCF-7、HEK293细胞的细胞核中,而Dox/P41纳米颗粒不能有效的透过细胞膜;CCK-8试验显示,游离Dox与Dox/P45纳米颗粒对A549细胞的IC50值分别为0.39±0.03μg/mL和0.57±0.05 μg/mL,差异具有统计学意义(p<0.05);对于MCF-7细胞,Dox/P45 纳米颗粒的 IC50 值为 2.2±0.04 μg/mL,而游离 Dox 的 IC50 值为 0.42±0.01 μg/mL,差异具有显著统计学意义(p<0.001);Dox/P45纳米颗粒对HEK293细胞没有明显的细胞毒性,而游离Dox表现出强烈的杀伤作用,IC50值为0.24±0.02μg/mL,差异具有显著统计学意义(p<0.001);Dox/P41纳米颗粒对A549、MCF-7、HEK293细胞表现出较低的细胞毒性,与游离Dox相比,差异均具有显著统计学意义(p<0.001)。Dox/P45和Dox/P41纳米颗粒的细胞毒性在HEK293细胞中相当,未观察到明显的毒性。研究结论:生理pH条件下,P45在抗肿瘤药物Dox的激发下自组装形成了均一的球形纳米载药颗粒(Dox/P45),其负电荷区域在自组装中起到了至关重要的作用;Dox/P45纳米颗粒能够靶向递送抗肿瘤药物,实现pH敏感的可控释放以及有效地杀伤肿瘤细胞,是一种智能、高效、安全的纳米药物载体;天然两亲性多肽可以用作纳米药物的载体,实现靶向递送及可控的药物释放,具有广阔的应用的前景。