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蛋白激酶在植物的抗性途径中起到了很重要的作用。编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的Pto基因,是第一个符合基因对基因假说的抗性基因。Pto过量表达的番茄品种对番茄细菌性斑点病(Pseudomonas syringae pv. tomato)表现抗性。玉米中已经克隆得到了Pti1相似基因ZmPti1。而在番茄中,Pto与Pti1相互作用,并磷酸化Pti1,激活下游信号传导途径。
因此,我们以番茄中的Pto蛋白激酶基因序列为探针,通过同源克隆的方法,分别从受到脱落酸(ABA)、甘露醇胁迫的玉米叶片中克隆得到一个相同的全长cDNA,其编码一个与Pto同源的蛋白,命名为ZmPto1(EU375843)。
通过蛋白序列分析发现,ZmPto1蛋白序列含有一个Ser/Thr蛋白激酶结构域,这表明ZmPto1可能是一个Ser/Thr蛋白激酶。生物信息学分析表明ZmPto1编码407个氨基酸,蛋白质推测其分子量是45.489 KD,等电点为5.85。进化树分析表明ZmPto1与水稻中的蛋白激酶基因亲缘关系较近。
半定量RT-PCR分析显示ZmPto1基因被脱落酸(ABA)、甘露醇诱导表达。在玉米不同的组织器官中ZmPto1基因转录水平的表达模式也不同。在玉米成熟叶、雄穗和胚芽鞘中没有检测到ZmPto1的表达,在子房和幼嫩叶片中表达水平较低,而在根和花丝中表达水平较高。随着玉米的生长,根中ZmPto1的mRNA表达水平有所下降。这些结果表明ZmPto1编码了一个新的Pto-like激酶,并且可能参与了非生物逆境的信号传导过程,同时也很有可能参与了植物发育过程的调控。
为了进一步验证ZmPto1的生物学功能,我们以(CaMV)35S为启动子、bar基因为筛选标记,构建了植物表达载体,在拟南芥中过量表达了ZmPto1。用1.2‰的除草剂喷洒筛选出阳性苗后通过PCR验证,已经得到转基因株系。
为确定ZmPto1生玉米信号传导途径中的地位,我们运用酵母双杂交的方法证明了ZmPto1与ZmPti1(GenBank:AY708048.1)相互作用。ZmPti1编码一个盐胁迫诱导表达的蛋白,转ZmPti1的拟南芥植株耐盐性增强。因此推测ZmPto1是信号传导通路的上游调控基因,与ZmPti1相互作用,诱导了耐盐信号通路。
ZmPto1是上游调控基因,很可能参与了其他的信号途径,我们在酵母双杂交系统中证明了ZmPto1与ZmPti1-1(GenBank:EF158035.1)相互作用。已经研究发现,转ZmPti1-1的拟南芥植株没有表型,但说明ZmPto1可能与下游多个蛋白相互作用,参与不同的信号通路。