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第一部分EGLN1在鼻咽癌及鼻咽良性病变黏膜上皮中的表达情况
目的：探讨EGLN1在鼻咽癌组织及鼻咽良性病变黏膜上皮组织的表达情况；了解EGLN1的表达是否与鼻咽癌患者的年龄，性别，TNM及临床分期等相关。
方法：诊断明确，分期清楚的鼻咽癌活检组织蜡块(124例)及鼻息肉活检组织蜡块(10例，对照组)来源于华中科技大学同济医学院附属同济医院病理科。所有病例在活检前均未接受任何抗肿瘤治疗(包括放疗、化疗、手术、靶向治疗、免疫治疗等)。我们使用免疫组织化学法IHC检测鼻咽癌组织及非癌鼻咽上皮组织中EGLN1的表达情况，随后对其表达进行评分及统计学分析。探讨EGLN1在肿瘤组织及良性病变组织中的表达差异，并进一步分析EGLN1的表达是否与鼻咽癌的TNM分期、临床分期、性别、年龄相关。
结果：通过免疫组织化学法检测及对EGLN1的表达评分进行统计学分析提示EGLN1在鼻咽癌组织中的表达较良性病变鼻咽上皮(鼻息肉)中表达高(5.363±0.3365vs2.100±0.3145，p=0.007)。在鼻咽癌患者中，T1-2期的患者EGLN1的表达量较T3-4期的患者低(3.512±0.4555vs6.346±0.4169,p<0.0001)，临床分期为I-II期的患者EGLN1的表达量明显低于III-IV期的患者(2.944±0.6075vs5.774±0.3660，p=0.0027)。除此之外，EGLN1的表达与鼻咽癌患者的性别，年龄，N分期，M分期无关。
结论：EGLN1在鼻咽癌组织中的表达明显高于鼻咽良性病变上皮组织(鼻息肉)；EGLN1的表达量与T分期，临床分期呈正相关关系。
第二部分EGLN1参与鼻咽癌细胞生物学行为的调控
目的：探讨EGLN1的表达水平与鼻咽癌细胞增殖生长，侵袭迁移能力及肿瘤干细胞表型的关系。
方法：构建EGLN1上调的鼻咽癌细胞系CNE2-EGLN1-OE(overexpression)及EGLN1下调的鼻咽癌细胞系CNE2-shEGLN1。使用Westernblot及PCR的方法分别从蛋白及RNA水平检测细胞系是否构建成功。随后，使用CCK8细胞增殖实验及克隆形成实验检测EGLN1对鼻咽癌细胞体外增殖和生长能力的影响。用划痕实验及transwell侵袭实验检测细胞的侵袭迁移能力。使用成球实验验证EGLN1对细胞干细胞表型的影响，并用Westernblot及免疫荧光的方法检测EGLN1与细胞干性分子标志物的关系。
结果：Westernblot及PCR实验分别从蛋白层面及RNA层面证实EGLN1干扰细胞株CNE2-shEGLN1及过表达细胞株CNE2-EGLN-OE构建成功。CCK8细胞增殖实验及克隆形成实验显示EGLN1可以增加细胞的增殖、生长能力。划痕实验及transwell实验证实EGLN1表达增多促进鼻咽癌细胞的侵袭迁移。干细胞成球实验表明EGLN1的表达可以促进CNE2干性形成，EGLN1表达量越高，细胞成球能力越强，成球数量越多。随后的Westernblot实验也表明了EGLN1过表达后细胞的肿瘤干细胞(cancer stem cell，CSC)相关分子标志物及转录因子CD44，CD133，ALDH，SOX2，Nanog，snail表达量上调；而EGLN1下调后CSC相关分子标志物下调。
结论：EGLN1可促进鼻咽癌细胞的生长增殖、侵袭转移及其干性形成。
第三部分EGLN1可在体内外促进鼻咽癌细胞系放射抵抗
目的：本部分研究旨在探讨EGLN1在体内外对鼻咽癌细胞系放射敏感性的影响。方法：首先在体外通过克隆形成的方法检测EGLN1对鼻咽癌细胞系放射敏感性的影响，使用单击多靶模型分析剂量-效应关系。使用8Gy的射线照射不同细胞系后，采用流式细胞分析的方法检测细胞的凋亡率以评价EGLN1的表达与放射所致凋亡的关系。γ-H2aX是DNA损伤的重要标志，制作细胞爬片后，使用免疫荧光的方法检测不同时间点γ-H2aX的表达。最后，我们取CNE2-control及CNE2-shEGLN1细胞系建立裸鼠皮下瘤模型，并对其进行放疗，验证EGLN1在体内对鼻咽癌细胞系增殖及放射敏感性的影响。
结果：经过照射后，CNE2-EGLN1-OE细胞的克隆形成率显著高于其相应对照组细胞，CNE2-shEGLN1细胞的克隆形成率低于其对照组细胞。流式细胞学分析证实在8Gy剂量的射线照射后，CNE2-EGLN1-OE细胞系的凋亡率低于对照组，反之，CNE2-shEGLN1的凋亡率较对照组升高。此外，免疫荧光检测表明EGLN1过表达可减少放疗所致的γ-H2aX的聚集及DNA损伤，而EGLN1敲除后，γ-H2aX的聚集较对照组细胞系显著增多。小鼠成瘤实验证实了放射治疗后，EGLN1敲除组的瘤体缩小较对照组快。
结论：在体内外，EGLN1敲除均可以增加鼻咽癌细胞系的放射敏感性；EGLN1过表达可诱导细胞放射抗拒。
第四部分EGLN1依赖其羟基化酶活性增加p53泛素化水平
目的：本研究旨在探讨EGLN1对鼻咽癌细胞系生物学行为及放射敏感性调节的内在机制。
方法：首先，我们用Westernblot的方法检测了CNE2-EGLN1-OE及CNE2-shEGLN1细胞中p53的表达水平及放疗后p53磷酸化及其下游通路的激活情况。使用放线菌酮(CHX)抑制蛋白合成后，检测了p53在EGLN1不同表达水平的细胞中半衰期变化情况。随后，我们在CNE2中分别过表达Flag-EGLN1及Flag-p53，使用CO-IP的方法从正反两个方面验证两者是否相互作用，并用液相色谱-质谱联用(即LC-MS/MS)的方法检测免疫沉淀蛋白。最后使用Westernblot的方法分析了EGLN1对p53泛素化水平的影响并验证是否与其羟基化酶活性相关。
结果：EGLN1过表达后p53表达水平较对照组降低，而EGLN1敲除后p53水平上调。在接受照射后，EGLN1过表达的细胞系中p53磷酸化水平及其下游通路激活水平降低，EGLN1敲除组细胞系中p53磷酸化水平及其下游通路激活水平升高。此外，我们发现，EGLN1过表达细胞系中p53的半衰期缩短，而EGLN1敲除的细胞系其半衰期延长。为验证EGLN1通过何种方式调节p53，我们使用CO-IP的方法正反两个方面均证实了EGLN1可以与p53结合，且同时与泛素化相关蛋白结合。因此，我们检测了EGLN1对p53泛素化水平的影响，结果显示EGLN1过表达可以增加p53的泛素化水平，加入羟基化酶抑制剂DMOG或下调EGLN1的表达后，p53泛素化水平下调。
结论：EGLN1可降低p53的表达及其下游通路的激活；EGLN1依赖于其羟基化酶活性调节p53的泛素化水平。
目的：探讨EGLN1在鼻咽癌组织及鼻咽良性病变黏膜上皮组织的表达情况；了解EGLN1的表达是否与鼻咽癌患者的年龄，性别，TNM及临床分期等相关。
方法：诊断明确，分期清楚的鼻咽癌活检组织蜡块(124例)及鼻息肉活检组织蜡块(10例，对照组)来源于华中科技大学同济医学院附属同济医院病理科。所有病例在活检前均未接受任何抗肿瘤治疗(包括放疗、化疗、手术、靶向治疗、免疫治疗等)。我们使用免疫组织化学法IHC检测鼻咽癌组织及非癌鼻咽上皮组织中EGLN1的表达情况，随后对其表达进行评分及统计学分析。探讨EGLN1在肿瘤组织及良性病变组织中的表达差异，并进一步分析EGLN1的表达是否与鼻咽癌的TNM分期、临床分期、性别、年龄相关。
结果：通过免疫组织化学法检测及对EGLN1的表达评分进行统计学分析提示EGLN1在鼻咽癌组织中的表达较良性病变鼻咽上皮(鼻息肉)中表达高(5.363±0.3365vs2.100±0.3145，p=0.007)。在鼻咽癌患者中，T1-2期的患者EGLN1的表达量较T3-4期的患者低(3.512±0.4555vs6.346±0.4169,p<0.0001)，临床分期为I-II期的患者EGLN1的表达量明显低于III-IV期的患者(2.944±0.6075vs5.774±0.3660，p=0.0027)。除此之外，EGLN1的表达与鼻咽癌患者的性别，年龄，N分期，M分期无关。
结论：EGLN1在鼻咽癌组织中的表达明显高于鼻咽良性病变上皮组织(鼻息肉)；EGLN1的表达量与T分期，临床分期呈正相关关系。
第二部分EGLN1参与鼻咽癌细胞生物学行为的调控
目的：探讨EGLN1的表达水平与鼻咽癌细胞增殖生长，侵袭迁移能力及肿瘤干细胞表型的关系。
方法：构建EGLN1上调的鼻咽癌细胞系CNE2-EGLN1-OE(overexpression)及EGLN1下调的鼻咽癌细胞系CNE2-shEGLN1。使用Westernblot及PCR的方法分别从蛋白及RNA水平检测细胞系是否构建成功。随后，使用CCK8细胞增殖实验及克隆形成实验检测EGLN1对鼻咽癌细胞体外增殖和生长能力的影响。用划痕实验及transwell侵袭实验检测细胞的侵袭迁移能力。使用成球实验验证EGLN1对细胞干细胞表型的影响，并用Westernblot及免疫荧光的方法检测EGLN1与细胞干性分子标志物的关系。
结果：Westernblot及PCR实验分别从蛋白层面及RNA层面证实EGLN1干扰细胞株CNE2-shEGLN1及过表达细胞株CNE2-EGLN-OE构建成功。CCK8细胞增殖实验及克隆形成实验显示EGLN1可以增加细胞的增殖、生长能力。划痕实验及transwell实验证实EGLN1表达增多促进鼻咽癌细胞的侵袭迁移。干细胞成球实验表明EGLN1的表达可以促进CNE2干性形成，EGLN1表达量越高，细胞成球能力越强，成球数量越多。随后的Westernblot实验也表明了EGLN1过表达后细胞的肿瘤干细胞(cancer stem cell，CSC)相关分子标志物及转录因子CD44，CD133，ALDH，SOX2，Nanog，snail表达量上调；而EGLN1下调后CSC相关分子标志物下调。
结论：EGLN1可促进鼻咽癌细胞的生长增殖、侵袭转移及其干性形成。
第三部分EGLN1可在体内外促进鼻咽癌细胞系放射抵抗
目的：本部分研究旨在探讨EGLN1在体内外对鼻咽癌细胞系放射敏感性的影响。方法：首先在体外通过克隆形成的方法检测EGLN1对鼻咽癌细胞系放射敏感性的影响，使用单击多靶模型分析剂量-效应关系。使用8Gy的射线照射不同细胞系后，采用流式细胞分析的方法检测细胞的凋亡率以评价EGLN1的表达与放射所致凋亡的关系。γ-H2aX是DNA损伤的重要标志，制作细胞爬片后，使用免疫荧光的方法检测不同时间点γ-H2aX的表达。最后，我们取CNE2-control及CNE2-shEGLN1细胞系建立裸鼠皮下瘤模型，并对其进行放疗，验证EGLN1在体内对鼻咽癌细胞系增殖及放射敏感性的影响。
结果：经过照射后，CNE2-EGLN1-OE细胞的克隆形成率显著高于其相应对照组细胞，CNE2-shEGLN1细胞的克隆形成率低于其对照组细胞。流式细胞学分析证实在8Gy剂量的射线照射后，CNE2-EGLN1-OE细胞系的凋亡率低于对照组，反之，CNE2-shEGLN1的凋亡率较对照组升高。此外，免疫荧光检测表明EGLN1过表达可减少放疗所致的γ-H2aX的聚集及DNA损伤，而EGLN1敲除后，γ-H2aX的聚集较对照组细胞系显著增多。小鼠成瘤实验证实了放射治疗后，EGLN1敲除组的瘤体缩小较对照组快。
结论：在体内外，EGLN1敲除均可以增加鼻咽癌细胞系的放射敏感性；EGLN1过表达可诱导细胞放射抗拒。
第四部分EGLN1依赖其羟基化酶活性增加p53泛素化水平
目的：本研究旨在探讨EGLN1对鼻咽癌细胞系生物学行为及放射敏感性调节的内在机制。
方法：首先，我们用Westernblot的方法检测了CNE2-EGLN1-OE及CNE2-shEGLN1细胞中p53的表达水平及放疗后p53磷酸化及其下游通路的激活情况。使用放线菌酮(CHX)抑制蛋白合成后，检测了p53在EGLN1不同表达水平的细胞中半衰期变化情况。随后，我们在CNE2中分别过表达Flag-EGLN1及Flag-p53，使用CO-IP的方法从正反两个方面验证两者是否相互作用，并用液相色谱-质谱联用(即LC-MS/MS)的方法检测免疫沉淀蛋白。最后使用Westernblot的方法分析了EGLN1对p53泛素化水平的影响并验证是否与其羟基化酶活性相关。
结果：EGLN1过表达后p53表达水平较对照组降低，而EGLN1敲除后p53水平上调。在接受照射后，EGLN1过表达的细胞系中p53磷酸化水平及其下游通路激活水平降低，EGLN1敲除组细胞系中p53磷酸化水平及其下游通路激活水平升高。此外，我们发现，EGLN1过表达细胞系中p53的半衰期缩短，而EGLN1敲除的细胞系其半衰期延长。为验证EGLN1通过何种方式调节p53，我们使用CO-IP的方法正反两个方面均证实了EGLN1可以与p53结合，且同时与泛素化相关蛋白结合。因此，我们检测了EGLN1对p53泛素化水平的影响，结果显示EGLN1过表达可以增加p53的泛素化水平，加入羟基化酶抑制剂DMOG或下调EGLN1的表达后，p53泛素化水平下调。
结论：EGLN1可降低p53的表达及其下游通路的激活；EGLN1依赖于其羟基化酶活性调节p53的泛素化水平。