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铁硫亚基蛋白(Rieske iron sulfur protein，RISP)是生物体呼吸链中重要的电子传递载体，是构成呼吸链复合物Ⅲ关键亚基蛋白之一。RISP在呼吸链电子传递过程中，负责将电子从还原型辅酶Q传递给细胞色素c1，并向线粒体膜间隙释放质子，使线粒体膜电位升高，用以合成ATP。沉默RISP，将可能切断线粒体呼吸链，降低生物体内ATP水平，使靶标生物因缺乏ATP而无法正常发育甚至死亡。深入研究RISP基因及其编码蛋白分子结构，对于设计新型呼吸链抑制剂具有潜在的应用意义。 本文以甜菜夜蛾Spodoptera exigua(Hubner)为供试昆虫，克隆了甜菜夜蛾线粒体复合物Ⅲ铁硫蛋白亚基基因SeRISP，分析了其基因和蛋白质结构特征，研究了其在甜菜夜蛾不同发育阶段的表达特征；构建了甜菜夜蛾、斜纹夜蛾S.litura、家蚕Bombyxmori、小菜蛾Plutella xylostella等鳞翅目代表性昆虫RISP原核表达载体，研究了其原核表达特征，并用小菜蛾RISP抗体免疫印迹检测了RISP同源蛋白；通过饲喂甜菜夜蛾幼虫dsRNA的方式，沉默了SeRISP的表达，鉴定了其在甜菜夜蛾能量代谢和生长发育过程中的功能。主要研究内容和结果如下。 根据GenBank中登录的昆虫RISP基因序列，设计简并引物，采用RT-PCR和RACE技术从甜菜夜蛾3龄幼虫克隆得到SeRISP全长序列(GenBank登录号：JN992290)，SeRISP cDNA全长1036 bp，其中编码区长816 bp，共编码271个氨基酸，分子量约为29.12kD，等电点为9.02；从甜菜夜蛾成虫总DNA中克隆得到SeRISP基因组DNA序列(GenBank登录号：JN992291)，该基因组DNA序列长约3799 bp，含有3个内含子，分别长为93 bp、938 bp和1949 bp，依次位于206～299 bp、444～1382 bp和1561～3510 bp处，三个内含子和其间隔外显子之间都符合GT-AG连接原则。 运用qRT-PCR检测了SeRISP在甜菜夜蛾不同发育时期表达特征，结果显示，SeRISP在甜菜夜蛾不同发育时期内均有表达，其表达量在1龄幼虫时期最低，随着甜菜夜蛾龄期增长，逐渐升高，从3龄到4龄时期，增长迅速，4龄以后维持在较高水平，并在成虫期达到最大值。 分别将甜菜夜蛾、斜纹夜蛾、家蚕和小菜蛾RISP ORF连接至pET32a原核表达载体，成功构建了供试四种昆虫RISP原核表达载体，分别导入表达菌株Transetta(DE3)，经IPTG诱导表达。供试四种鳞翅目昆虫RISP原核表达蛋白约29 kD，与pET32a载体上Trx·Tag、S·Tag和His·Tag约18 kD共同构成约47 kD左右的融合蛋白，存在经超声波破碎后菌体上清液中。 根据甜菜夜蛾、斜纹夜蛾、家蚕和小菜蛾RISP拥有相似的3D结构，推测其具有相类似的抗原决定簇，以小菜蛾RISP抗体作为一抗，运用Western blot技术，分别成功免疫印迹检测了甜菜夜蛾、斜纹夜蛾、家蚕、小菜蛾RISP原核表达蛋白和RISP活体蛋白，说明在拥有相似的3D结构和抗原决定簇的基础上，小菜蛾RISP抗体在RISP同源蛋白之间具有相互免疫的能力。 通过饲喂dsRNA的方式，沉默SeRISP，鉴定SeRISP在甜菜夜蛾幼虫生长发育中的功能。结果表明，SeRISP-dsRNA以4μg/μL和2μg/μL的浓度饲喂甜菜夜蛾2龄幼虫24 h后，SeRISP mRNA水平抑制率分别为46.3％和26.7％，蛋白质表达变化不明显，ATP合成抑制率分别为17.2％和21.1％，体重抑制率分别为43.1％和40.2％。随着处理时间的延长，SeRISP的mRNA水平、蛋白质表达、ATP合成、以及体重增长均受到显著抑制，至饲喂后96 h，SeRISP mRNA水平抑制率分别为96.3％和92.4％，蛋白质表达抑制显著，ATP合成抑制率分别为36.7％和34.2％，体重抑制率分别为77.3％和76.8％。饲喂甜菜夜蛾2龄幼虫4μg/μL和2μg/μL SeRISP-dsRNA96 h后，幼虫化蛹率分别91.7％和94.4％，蛹重抑制率分别为27.1％和17.8％，成虫产孵抑制率分别为62.5％和56.4％，卵孵化抑制率分别为29.3％和15.7％。 结合研究结果，讨论了SeRISP的基因结构特征、表达时序性、原核表达及免疫印迹特征和RNAi效果。本文首次阐明了SeRISP的基因结构和蛋白质结构特征，并从甜菜夜蛾活体水平上证实了通过饲喂幼虫dsRNA可以显著沉默SeRISP，抑制其功能的发挥，为今后深入研究昆虫RISP功能，研制以其为主要作用靶标的新型杀虫剂提供了参考。