研究背景:甲状腺激素是由甲状腺合成和分泌的,在人体的正常发育、分化和代谢过程中起着至关重要的作用,是糖脂代谢和能量稳态的重要调节因子。甲状腺功能减退症是内分泌系统的一种常见而严重的疾病,是各种因素导致的甲状腺激素合成及分泌减少,或生理效应不足而引起的一种疾病,属于全身性低代谢综合征。甲状腺素缺乏症是指血清甲状腺素总量（TT4）过低,通过下丘脑-垂体-甲状腺轴的负反馈导致促甲状腺素（Thyroid stimulating hormone,TSH）浓度升高。原发性甲状腺功能减退是甲状腺功能低下症的一种,是由甲状腺自身功能障碍引起的,是甲状腺功能减退的主要原因。成人甲状腺功能减退症的发病往往很隐秘,表现为一系列非特异性症状。然而,如果严重的甲状腺功能减退得不到及时治疗,可能导致预后不良,如心力衰竭、精神病,甚至昏迷。到目前为止,治疗甲状腺功能减退的措施主要包括改善症状和预防不良事件。毫无疑问,甲状腺功能减退给经济带来了巨大的负担,也大大降低了患者的生活质量。因此,研究其发病机制和探索新的治疗策略是十分必要的。翻译后修饰（Post-translational modification,PTMs）是指以酶促或非酶促方式对蛋白质氨基酸进行的共价修饰,是增加蛋白质组多样性的关键机制,对多种物种的生物学功能具有重要影响。PTMs通过蛋白水解裂解调控亚基向一个或多个氨基酸添加修饰基团或降解整个蛋白质来调节蛋白质的性能,从而确定活性状态、定位、转化以及与其他分子的相互作用。赖氨酸是最常见的翻译后修饰氨基酸残基,对蛋白质结构的形成和功能的调节起着至关重要的作用。赖氨酸残基可以被多种PTMs作用,如甲基化、乙酰化、泛素化、丙酰化和丁二酰化。这些赖氨酸PTMs在细胞生理和病理过程中发挥重要作用,从而影响细胞生物学和发病机制的几乎所有方面。赖氨酸琥珀酰化是一种重要的蛋白质翻译后修饰,可以通过非酶化学反应和酶催化反应发生在胞质、核和线粒体蛋白上。非酶化学反应的琥珀酰化直接来源于琥珀酰辅酶A,可由TCA循环、脂类和氨基酸代谢产生,赖氨酸的酶促琥珀酰化是由赖氨酸琥珀酰转移酶产生的。赖氨酸琥珀酰化已被确认为PTM的一种重要形式,并参与甲状腺疾病相关的多种细胞功能。已有研究发现H3组蛋白9-14位赖氨酸乙酰化水平（H3K9-K14ac）在滤泡腺瘤、乳头状甲状腺癌、滤泡性甲状腺癌和未分化癌中显著高于正常组织;Cys10的氧化修饰影响T3与甲状腺素运载蛋白的结合,为精确研究甲状腺激素的有效性提供了可能的机制。赖氨酸琥珀酰化在甲状腺疾病中的作用尚不清楚,仍需要进一步研究。我们先前的研究发现,过量摄入膳食脂肪不仅会导致甲状腺形态及脂质含量等的异常同时导致血清TT4、FT4浓度下降与血清TSH浓度升高,为脂质与器官功能的相关性提供了证据,也为了解甲状腺功能减退的发病机制提供了新的证据。然而,其潜在的分子机制尚不清楚,需要进一步研究。由于其高通量和准确性,基于（LC-MS/MS）的蛋白质组检测已成为研究疾病机制的强大工具。在本研究中,我们先通过Western blotting检测了琥珀酰化、巴豆酰化、2-羟基丁酰化和丙二酰化四种类型的赖氨酸酰化水平。与对照组相比,HFD组赖氨酸琥珀酰化水平有明显变化。然后,我们采用LC-MS/MS方法对HFD组与SD组大鼠的甲状腺组织蛋白质组和赖氨酸琥珀酰化进行非标标签定量分析。进行了一系列的生物信息学分析,以探索高脂饮食导致低甲状腺素血症的潜在分子机制,以及赖氨酸琥珀酰化参与的可能调控机制。研究目的1.高脂饮食诱导低甲状腺素血症大鼠甲状腺组织的蛋白质组与琥珀酰化修饰组分析。2.探讨赖氨酸琥珀酰化与甲状腺功能减退之间的关系。3.线粒体功能与线粒体蛋白质琥珀酰化修饰水平是否存在关联性。4.探索甲减血症的潜在分子机制,并评估潜在的诊断生物标志物和治疗靶点。研究方法:1.建立高脂饮食诱导低甲状腺素血症的大鼠动物模型:将6周龄雄性SD大鼠置于恒温恒湿条件下,进行12h:12h的明暗循环。将大鼠随机等分为CD对照组（n=13）和HFD研究组（n=13）。这些动物每周称重,连续24周进食。喂养第24周,所有大鼠在宰杀前禁食12小时。实验方案均经山东大学山东省医院动物伦理委员会批准。2.血清甲状腺功能参数检测分析:大鼠宰杀前,下腔静脉穿刺采血,收集血清。ELISA试剂盒测定血清TT4、FT4和TSH。所有程序都按照制造商提供的说明进行。3.大鼠甲状腺组织收集:从处死的甲状腺功能减退的实验大鼠取出甲状腺组织,按照4、4与5只大鼠的甲状腺组织混合组织样本分别作为3个生物学重复。4.总蛋白质组与琥珀酰化组蛋白质组定量检测及分析4.1总蛋白提取:样品从-80℃取出,称取适量组织样品至液氮预冷的研钵中,加液氮充分研磨至粉末。各组样品分别加入4倍体积裂解缓冲液（8 M尿素,1%蛋白酶抑制剂,3 μ M TSA,50 mM NAM和2 mM EDTA）,超声裂解。4℃,12000 g离心10 min,去除细胞碎片,上清液转移至新的离心管,利用BCA试剂盒进行蛋白浓度测定。4.2胰酶酶解:蛋白溶液中加入二硫苏糖醇使其终浓度为5 mM,56℃还原30 min。之后加入碘代乙酰胺使其终浓度为11 mM,室温避光孵育15 min。最后将样品的尿素浓度稀释至低于2M。以1:50的质量比例（胰酶:蛋白）加入胰酶,37℃酶解过夜。再以1:100的质量比例（胰酶:蛋白）加入胰酶,继续酶解4 h。4.3基于抗体的修饰富集:将肽段溶解在IP缓冲溶液中（100 mM NaCl,1 mM EDTA,50 mM Tris-HCl,0.5%NP-40,pH 8.0）,转移上清液至提前洗涤好的琥珀酰化树脂中（抗体树脂货号PTM402,来源于杭州景杰生物科技有限公司）,放置于4℃环境的旋转摇床上,温和摇晃并过夜孵育。孵育结束后依次使用IP缓冲溶液洗涤树脂4次,去离子水洗涤两次。最后使用0.1%三氟乙酸洗脱液,将树脂结合的肽段洗脱下来,共洗脱三次,收集洗脱液并真空冷冻抽干。抽干后按照C18 ZipTips说明书除盐,真空冷冻抽干后供液质联用分析。4.4 HPLC分级:肽段用高pH反向HPLC分级,色谱柱为Agilent 300Extend C18（5μm粒径,4.6 mm内径,250 mm长）。操作如下:肽段分级梯度为8%-32%乙腈、pH 9,60 min时间分离60个组分,随后肽段合并为4个组分,合并后的组分经真空冷冻干燥后进行后续操作。4.5液相色谱-质谱联用分析:肽段用液相色谱流动相A相（0.1%（v/v）甲酸水溶液）溶解后使用EASY-nLC 1000超高效液相系统进行分离。流动相A为含0.1%甲酸和2%乙腈的水溶液;流动相B为含0.1%甲酸和90%乙腈的水溶液。液相梯度设置:0-38 min,7%～25%B;38-52 min,25%～40%B;52-56 min,40%～80%B;56-60min,80%B,流速维持在700nL/min。肽段经由超高效液相系统分离后被注入NSI离子源中进行电离然后进Q ExactiveTM Plus质谱进行分析。离子源电压设置为2.1 kV,肽段母离子及其二级碎片都使用高分辨的Orbitrap进行检测和分析。一级质谱扫描范围设置为350-1800 m/z,扫描分辨率设置为70,000;Orbitrap扫描分辨率设置为17,500。数据采集模式使用数据依赖型扫描（DDA）程序,即在一级扫描后选择信号强度最高的前15肽段母离子依次进入HCD碰撞池使用28%的碎裂能量进行碎裂,同样依次进行二级质谱分析。为了提高质谱的有效利用率,自动增益控制（AGC）设置为5E4,信号阈值设置为10000 ions/s,最大注入时间设置为200 ms,串联质谱扫描的动态排除时间设置为30秒以避免母离子的重复扫描。4.6数据库检索与定量分析:二级质谱数据使用Maxquant（v1.5.2.8）进行检索。检索参数设置:数据库为UniProt Rat（29795条序列）,添加了反库以计算随机匹配造成的假阳性率（FDR）,并且在数据库中加入了常见的污染库,用于消除鉴定结果中污染蛋白的影响;酶切方式设置为Trypsin/P;漏切位点数设为2;肽段最小长度设置为7个氨基酸残基;肽段最大修饰数设为5;First search和Main search的一级母离子质量误差容忍度分别设为20 ppm和5 ppm,二级碎片离子的质量误差容忍度为0.02 Da。将半胱氨酸烷基化设置为固定修饰,可变修饰为甲硫氨酸的氧化,蛋白N端的乙酰化。蛋白鉴定、PSM鉴定的FDR都设置为1%。每个样品在三次重复中通过LFQ强度获得定量值。第一步是计算两个样品之间蛋白质的差异浓度。首先计算每个样本在多次重复中定量值的平均值,然后计算两个样本平均值的比值。这个比率被用作最终的定量。为了规范化琥珀酰化肽,首先测量琥珀酰化肽的裸强度,然后用相应的蛋白强度进行划分。4.7质谱质控检测:质量误差以0为中轴并且集中在低于10 ppm的范围内,说明质量误差符合要求。其次,绝大部分的肽段长度分布在8-20个氨基酸残基之间,符合胰酶消化肽段的规律,说明样品制备达到标准。4.8蛋白质功能富集:（1）GO富集分析蛋白的GO注释被分为3个大类:生物进程、细胞组成、分子功能。费歇尔精确双端检验方法（Fisher’s exact test）被用于检验差异表达蛋白在以鉴定到的蛋白为背景,在GO各分类下的富集程度。GO富集检验P-value值小于0.05被认为是显著的。（2）通路富集分析Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）数据库被用于通路的富集分析。费歇尔精确双端检验方法被用于检验差异表达蛋白在以鉴定到的蛋白为背景,在各种通路中的富集程度。通路富集检验P-value值小于0.05被认为是显著的。最后根据KEGG网站通路层级分类方法将这些通路进行分类。（3）蛋白结构域富集分析InterPro（对蛋白序列的家族分类、结构域和特殊位点的预测等功能分析提供资源）数据库用于分析差异表达蛋白的功能结构域的富集情况。费歇尔精确双端检验方法被用于检验差异表达蛋白在以鉴定到的蛋白为背景,在各结构域中的富集程度。结构域单元富集检验P-value值小于0.05被认为是显著的。4.9蛋白质与蛋白质相互作用通过STRING（http://string-db.org/）分析,输入差异蛋白和具有显著丰度变化的琥珀酰化蛋白。对于互作可信度打分阈值设置为>0.700为可信的蛋白互作。最后,蛋白质互作网络图用可视化Cytoscape软件包分析输出。5.人正常甲状腺上皮细胞系Nthy-ori3-1（ECACC,Wiltshire,UK）体外培养:在RPMI-1640中,培养含10%胎牛血清(胎牛清、青霉素（100IU/ml）、链霉素（100 IU/ml）和L-谷氨酰胺（2 mM）,在37℃,含5%CO2的湿化培养箱中。6.免疫沉淀反应:通过免疫沉淀富集典型蛋白。细胞培养24小时,PA（0.2 mM）和NAM（10 mM）处理后,再培养24小时。然后用冰冷的PBS洗涤细胞三次,并在1 ml冰冷的RIPA裂解缓冲液中裂解（50 mM Tris,150 nM NaCl,1%脱氧胆酸钠,1%Triton-X-100,1mM EDTA,0.1%SDS,10mM NaF,1mM 原钒酸钠,1mM PMSF,10mM NAM）。从平板上刮去细胞,12000 g离心细胞裂解液15分钟。收集上清,BCA试剂盒测定蛋白浓度。IP取总蛋白500ug。蛋白与一抗一起在4℃的温和摇动中孵育过夜。免疫复合物使用蛋白A琼脂糖珠免疫沉淀。免疫沉淀用裂解液洗涤四次。最后,将每个珠粒重悬于2×Reducing Loading Buffer（130 mM Tris pH 6.8,4%SDS,0.02%溴酚蓝,20%甘油,100 mM DTT）中,在100℃煮沸5 min。样品在-80℃保存,然后进行western blotting检测。7.Western blot实验检测验证代表性蛋白琥珀酰化水平:将来自不同处理IP富集产物的等量蛋白质置于8%的SDS-PAGE中,然后电转转膜。用5%（w/v）脱脂牛奶TBST封闭膜,4℃与pan抗琥珀酰赖氨酸抗体孵育过夜。同样的膜用抗GAPDH抗体重新孵育。GAPDH蛋白作为总蛋白的内参对照。8.细胞线粒体耗氧率（Oxygen Consumption Rate,OCR）测定:耗氧率是正常细胞功能的一项重要指标,它是研究线粒体功能的重要参数。OCR测量是使用XF96分析仪（Agilent,美国）,根据制造商的说明进行。简单地说,大约每孔7×103个细胞接种到海马XF96细胞培养微板（Seahorse Bioscience,USA）上,培养24小时。PA（0.2 mM）和NAM（10 mM）处理后,再培养24小时。然后,将细胞转移至低缓冲和无碳酸氢盐的实验培养基（含2mm谷氨酰胺、1mm丙酮酸钠和25mm葡萄糖的XF碱性培养基）中,在37℃无CO2培养箱中孵育1小时。然后,在XFe 96细胞外通量分析仪（Agilent,美国）中测量OCRs,3个周期,每个周期混合3分钟。将结果归一化到相应的每孔蛋白总浓度。研究结果:1.测定血清TT4、FT4和TSH,观察甲状腺功能。HFD组TT4、FT4浓度降低（P<0.01）,TSH浓度升高（P<0.01）。结果表明,低甲状腺素血症大鼠模型的建立是成功的。2.采用高效液相色谱分离和高分辨率LC-MS/MS分析进行定量总蛋白质组测定。Pairwise Pearson相关系数显示了实验足够的再现性。共鉴定蛋白3869个,其中定量蛋白2982个。HFD组与CD组相较,以变化阈值大于1.5（p值<0.05）作为显著上调、小于1/1.5（p值<0.05）作为显著下调的变化标准,共有129个蛋白被量化为两组之间的差异表达蛋白,其中69个蛋白上调,60个蛋白下调。3.将大鼠甲状腺蛋白组数据与Human Protein Atlas数据库（www.proteinatlas.org）进行比较,我们的检测结果中可以发现甲状腺组织中一些标志性蛋白。例如,在MS检测到的所有蛋白质中,甲状腺球蛋白（Thyroglobulin,Tg）最为丰富,它是合成甲状腺激素甲状腺素（T4）和三碘甲状腺素（T3）的底物。甲状腺过氧化物酶也高表达,参与甲状腺激素生物合成途径。蛋白图谱甲状腺数据库中的碘酪氨酸脱碘酶1、降钙素基因相关肽2等特异性蛋白也存在于我们的蛋白检测表中。4.GO富集分析差异表达蛋白的生物学过程和分子功能显示,在细胞成分中,定位于核糖体和核糖体亚基的蛋白表达增加,而定位于线粒体和ATP酶复合物的蛋白表达明显下降。在分子功能方面,核糖体的结构成分和结构分子活性上调,ATP酶活性下调。在生物过程类中,上调的蛋白在几个代谢过程（包括肽、细胞酰胺和大分子代谢）、生物合成过程（肽、酰胺、高分子、有机物生物合成等）和翻译中显著富集。相反,一些下调的蛋白在氮循环和硫代谢等代谢过程中富集。5.为了进一步研究这些差异表达蛋白的功能,我们还进行了 KEGG通路的富集分析。与GO分析结果一致,结果显示核糖体途径是上调蛋白最显著的富集途径。同时,观察到下调蛋白在甲状腺激素信号通路和甲状腺激素合成中富集,提示这些通路可能在低甲状腺素血症的发生中发挥重要作用。6.使用基于抗体的亲和富集,然后进行LC-MS/MS赖氨酸琥珀酰化位点检测与定量分析。共鉴定了 250个蛋白上的685个琥珀酰化位点,其中229个蛋白上的621个琥珀酰化位点被量化并归一化到蛋白质组数据中。HFD组与CD组相较,以变化阈值大于1.5（p值<0.05）作为显著上调、小于1/1.5（p值<0.05）作为显著下调的变化标准,172个琥珀酰化位点对应104蛋白质（其中5个蛋白质上的7个琥珀酰化位点水平上调,99个蛋白质上的165个琥珀酰化位点水平下调）。7.与CD组相比,HFD组差异蛋白上的赖氨酸琥珀酰化大部分发生下调变化,而且这些琥珀酰化蛋白位于线粒体中,包括ATP合酶复合物、异柠檬酸脱氢酶（IDH2）。然而,甲状腺球蛋白上几个赖氨酸位点的琥珀酰化被上调。GO生物过程的富集分析显示,三羧酸循环、使用酰基辅酶A脱氢酶的脂肪酸-氧化、氧化-还原过程、脂肪酸-氧化和脂质稳态等前5个GO最显著。分子功能富集分析显示脂酰辅酶A结合和相关代谢显著富集。8.差异改变琥珀酰化蛋白的富集分析:在细胞成分中,下调的琥珀酰化蛋白主要为三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle,TCA cycle）酶复合物,分子功能富集最显著是连接酶活性,在生物过程类,琥珀酰化上调富集的蛋白是参与对脂质调节过程的,而参与柠檬酸代谢过程、细胞呼吸、三羧酸循环、氧化柠檬酸代谢过程、能源来源的有机化合物和有氧呼吸的蛋白质琥珀酰化是显著下调的。KEGG通路富集分析表明,柠檬酸循环（TCA循环）是下调琥珀酰化蛋白中富集最多的通路。9.差异表达的蛋白与琥珀酰化水平发生显著改变的蛋白质与蛋白质互作分析:差异表达的蛋白质互作网络分析揭示显著上调的核糖体蛋白聚体成互作网络,而琥珀酰化修饰水平显著差异表达的蛋白互作网络聚积在柠檬酸循环（TCA循环）,ATP合酶复合物、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的降解,而且这些蛋白的琥珀酰化修饰水平都是显著下调的。10.细胞线粒体耗氧率（OCR）测定结果:为了进一步验证上述组学分析结果及研究脂肪酸在线粒体功能中的作用,我们测量了正常人甲状腺上皮细胞中代表线粒体功能水平的OCR。用棕榈酸处理细胞24小时后,与线粒体OCR相关的基础呼吸、ATP产量和最大呼吸均明显下降（p<0.05）。而添加棕榈酸和去琥珀酰化酶抑制剂共同处理人甲状腺上皮细胞后,则逆转了线粒体OCR上述变化（p<0.05）。11.代表性蛋白琥珀酰化水平验证实验:为了确定蛋白质琥珀酰化在人正常甲状腺上皮细胞系中的变化,我们进行了蛋白质免疫沉淀分析,结合western blotting检测异柠檬酸脱氢酶2（IDH2）琥珀酰化水平。IDH2被认为是三羧酸循环的关键限速酶。Nthy-ori3-1细胞分别用去乙酰化抑制剂（NAM）、棕榈酸（PA）或同时用NAM和PA处理。结果表明,IDH2确实发生了琥珀酰化,PA对其琥珀酰化修饰有明显抑制作用。单独用NAM处理,IDH2琥珀酰化水平无明显变化,但与PA处理后相比,PA和NAM同时处理使IDH2琥珀酰化水平明显恢复。研究结论:1.通过用高脂饮食诱导大鼠,我们成功地建立了低甲状腺素血症的动物模型;2.我们采用LC-MS/MS-based定量蛋白质组学策略和富集琥珀酰化蛋白的策略,研究甲状腺组织中的琥珀酰化情况,鉴定了 129个差异表达的蛋白和172个差异表达的琥珀酰化位点,HFD组相较于CD组,琥珀酰化位点修饰水平显著下调远多于上调的位点。3.通过生物信息学深度挖掘分析,我们分析发现琥珀酰化修饰水平显著下降的蛋白主要定位于线粒体,并与线粒体功能相关。4.通过对正常人甲状腺上皮细胞中代表线粒体功能水平的OCR检测研究发现,用棕榈酸处理细胞24小时后,与线粒体OCR相关的基础呼吸、ATP产量和最大呼吸明显下降（P<0.05）。而添加棕榈酸和去琥珀酰化酶抑制剂共同处理人甲状腺上皮细胞后,则逆转了线粒体OCR上述变化（p<0.05）。5.通过免疫沉淀与Western blot实验,在用添加棕榈酸培养细胞后,线粒体中关键蛋白柠檬酸脱氢酶2（IDH2）总蛋白表达水平基本没有改变,而IDH2琥珀酰化修饰水平明显降低,这与我们甲减大鼠动物模型的琥珀酰化组的结果是一致的。6.综合OCR实验数据结果与免疫沉淀与Western blot实验对线粒体关键蛋白IDH2琥珀酰化水平验证结果,线粒体的功能与其中关键蛋白的琥珀酰化水平是正相关的。下调赖氨酸琥珀酰化的蛋白主要定位于线粒体,并与线粒体活性降低共发生。