子宫内膜异位症(Endometriosis, EMs)指具有生长功能的子宫内膜组织(腺体和间质)出现在子宫腔被覆内膜及宫体肌层以外的其他部位。是一种常见的妇科疾病,在育龄期妇女中的发病率高达10%-15%,子宫内膜异位症所引起的不孕、痛经、慢性盆腔痛等症状严重影响了患者的身心健康和生活质量。手术或者手术联合药物治疗是EMs目前最主要的治疗手段。但术后复发已经成为治疗子宫内膜异位症一个非常棘手的问题,术后5年累积复发率高达40%-50%,其复发率高,复发时间短等已经严重影响了患者的生活质量。因此减少复发对提高EMs治愈率具有重大的临床意义。腹腔镜手术有着创伤小、术后疼痛轻微、住院时间短、恢复快以及独特的美容效果等优点。相比开腹手术,能早期发现和更彻底的清除异位子宫内膜微小病灶,是EMs诊断的金标准及治疗的首选方式,并且已在妇产科领域广泛应用。虽然腹腔镜手术在治疗EMs细微病灶和彻底性方面比进腹手术有更显著的优势,但其复发率却无明显下降。众所周知,和开腹手术不同的是,腹腔镜手术需要持续灌注二氧化碳(CO2)以保持人工气腹。其无色、非炎性、不可燃,且能通过呼吸道迅速排出体外,同时相比其它可用于气腹的气体,CO2易溶于水,减少了气体栓塞这种腹腔镜术中最严重并发症的发生,迄今被认为是气腹的理想气体。已知CO2具有活跃的生理功能并对机体产生病理生理效应,尤其是改变腹腔内环境而影响腹腔内病变。这迫使我们深思,腹腔镜手术方式本身尤其是人工气腹介质CO2气体本身是否会影响残留异位内膜细胞的生长,从而参与了EMs的复发?迄今为止尚未发现有关CO2气体与EMs及异位内膜细胞生长关系的报道。近年发现,CO2气体与肿瘤环境、局部免疫及肿瘤细胞的生长、种植与转移等关系密切。CO2可通过引起腹腔镜局部酸中毒、低温、组织干燥及机械压力升高等促进腹腔内肿瘤如卵巢癌、结肠癌、肝癌等腹腔内残留肿瘤细胞播散及穿刺部位种植,其严重程度与C02气体人工气腹的灌注压力和时间呈正相关。此外,C02气体尚可通过改变肿瘤患者腹腔局部微环境,如诱导肿瘤转移相关的粘附分子、血管生长因子、基质金属蛋白酶等表达,抑制腹腔免疫细胞的数量和活性,改变腹腔内多种细胞因子表达水平等促进肿瘤细胞的种植生长和侵袭。在众多关于C02气体的研究中,其对肿瘤细胞生长的影响尤为引人注目。有研究表明,CO2气体本身具有刺激某些肿瘤细胞存活和生长的效应,在经过CO2气体处理后,细胞活性明显增强,且细胞凋亡减少。但目前CO2气体促进肿瘤生长的确切机制还不清楚。EMs尽管是一种良性病变,但异位的子宫内膜病灶却表现出异常的种植、侵袭、甚至转移、复发等类似恶性肿瘤的生物学表型。异位子宫内膜细胞本身还具有异常的凋亡特征。基于对EMs的病因、发病机制、复发及腹腔镜手术微环境的深入分析,设计了本课题。首先建立异位子宫内膜细胞原代培养的方法,设计简单、便携的腹腔镜气腹模拟装置建立人工气腹,给予不同压力的CO2气体处理不同的时间后,选择三个时间点来检测CO2气腹对异位子宫内膜细胞生长、凋亡的影响。筛选影响最强的压力、时间点和处理时间；利用蛋白芯片技术筛查显著影响的蛋白,并进一步进行验证。为将来改进EMs手术方式以及减少术后复发提供新的思路。第一部分腹腔镜CO2气腹对异位子宫内膜细胞生长和凋亡的影响目的：探讨腹腔镜CO2气腹对原代培养的异位子宫内膜细胞体外增殖和凋亡能力的影响。方法：原代培养异位子宫内膜细胞；建立腹腔镜CO：气腹体外模型；在细胞处于对数生长期时,以不同压力15mmHg)的CO2气腹对传代的异位子宫内膜细胞分别处理不同时间(1h、2h),设未处理组为对照。分别于处理后的24h,48h,72h进行细胞形态的鉴定(倒置相差显微镜、透射电镜)、采用流式细胞仪检测各组细胞周期分布；采用Annexin-V-FITC双染法测凋亡比例；运用TUNEL去检测各组的晚期凋亡。结果：1.原代培养的异位子宫内膜细胞在倒置显微镜镜下观察可见间质细胞呈梭行、平行状排列。腺上皮稀少,呈团状、漩涡状排列,细胞呈多角形或蝌蚪形。其形态同在位内膜间质细胞和腺上皮细胞相似。传代后,99%的细胞均为间质细胞。2.二氧化碳气腹组与对照组比较,pH值显著下降(p<0.05)；高压力组和低压组之间比较,高压力组pH值下降幅度又大于低压力组；压力越大,pH值下降越大,其中15mmHg二氧化碳气腹后pH下降大最低6.1；相同压力下,作用时间越长pH下降越显著。3小时候后各组细胞外液pH基本恢复至7.2。3.在二氧化碳环境下,各组细胞增殖指数没有显著区别(p>0.05)。4.低压力组(5mmHg、10mmHg)与对照组相比细胞凋亡比例无显著差别(p>0.05)。而高压力组(15mmHg)作用2h,常规培养48h组凋亡比例明显小于对照组(p<0.05)。结论：1.采用胶原酶和DNase I联合消化法培养异位子宫内膜细胞,提高了异位子宫内膜细胞的培养成功率。为进一步探讨子宫内膜异位症(EMs)的发生发展提供一个更为理想的细胞模型。2.体外模拟腹腔镜CO2气腹装置,无菌性强,容易操作。较好地模拟了腹腔镜手术过程中CO2气腹状态。3.在临床常用压力范围内(<15mmHg),CO2对异位子宫内膜细胞凋亡无明显影响,而15mmHg压力下,作用一定时间后,CO2可抑制异位内膜细胞的凋亡。提示在高CO2气腹可能通过抑制异位子宫内膜细胞的凋亡而促进其复发。第二部分腹腔镜CO2气腹抑制异位子宫内膜细胞凋亡的蛋白质组学研究目的：比较CO2气腹组和正常对照组差异表达的凋亡相关蛋白,寻找可能参与CO2气腹抑制异位子宫内膜细胞凋亡的相关蛋白质。方法：体外培养异位子宫内膜细胞,在细胞处于对数生长期时予以15mmHg CO2气腹处理2h,并常规培养48h后收集细胞。采用RayBio(?) Human Apoptosis Antibody ArrayI抗体芯片来筛查参与抑制异位子宫内膜细胞凋亡的相关蛋白。并运用real-timePCR在基因水平、western blot在蛋白水平进行验证。结果：CO2气腹组和正常对照组异位子宫内膜细胞凋亡抗体芯片结果存在差异。共找到8个表达水平差异的蛋白质。选择其中Livin, BCL-2, XIAP为代表性蛋白进行验证,结果显示XIAP与蛋白芯片结果一致。结论：1.CO2气腹组和正常对照组异位子宫内膜细胞凋亡抗体芯片结果存在差异。差异表达的蛋白以凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins, IAPs)家族的成员最为显著。2. XIAP即x连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein)在气腹组的高表达可能使异位子宫内膜细胞避开凋亡,逃离生长监控而异常增生,促进EMs的成长与发展从而参与了EMs的复发。