背景:脑卒中具有发病率高、死亡率高和致残率高的特点。缺血性脑卒中占脑卒中绝大多数,所占比例约87%。脑卒中是全球60岁以上人口第二位死亡原因和15～59岁人口第五位死亡原因,在我国脑卒中已经成为城市第三位和农村人口第二位死亡原因。目前我国脑卒中患者约750万,其中450万致残,丧失劳动能力或基本生活自理能力;每年新发病例250万,我国缺血性脑卒中发病率仍以每年8.7%的速率上升。脑卒中严重危害人类健康,造成患者及其家庭和国家严重的医疗、经济和社会负担,我国每年脑卒中造成的经济损失高达400亿元,是其他心血管疾病的10倍。缺血性脑卒中的发病机制极其复杂,与能量耗竭、氧化应激、兴奋性氨基酸的毒性作用、一氧化氮(NO)、钙超载、细胞凋亡、炎症等密切相关。缺血性脑卒中临床治疗方法是溶栓,美国FDA批准的唯一溶栓药物是组织纤溶酶原激活剂(tissue plasminogen activator,t PA),治疗时间窗仅为脑卒中发病后4.5小时,因此绝大多数患者得不到有效救治。几十年来全球医生和科学家们一直致力于神经保护药物的研究,虽然这些药物在实验室研究中取得了巨大进展,但是在后期的临床试验中都失败了。寻找治疗缺血性脑卒中的新策略和新药物是脑卒中研究的热点和难点。缺血性脑卒中发生时,缺血缺氧可促进机体发生代偿性血管新生,但过程缓慢,作用很弱。通过给予药物促进脑缺血局部血管新生,建立新的循环通路以有效缓解缺血引起的神经损伤,并对神经再生及神经功能恢复产生治疗作用,这种方法就是治疗性血管新生,治疗性血管新生有望成为临床治疗缺血性脑卒中的新策略。我室前期研究报道血管内皮细胞存在α7 n ACh R,参与血管新生调节,其激动剂胆碱,能够增加内皮细胞胞内Ca2+浓度,促进内皮细胞增殖及体外血管索形成,促进心梗组织侧枝循环的建立。提出α7 n ACh R可能是治疗心脑血管缺血性疾病的新靶标。胆碱是否可以促进脑血管新生从而提供脑保护以治疗缺血性脑卒中有待研究。本研究以永久性局灶性脑缺血大鼠和低氧诱导下大鼠脑微血管内皮细胞为研究对象,观察胆碱对缺血性脑卒中的治疗作用及其血管新生相关机制。方法:1.动物实验分组与给药方法雄性SD大鼠(体重280±20g)随机分为8组,每组18只,包括假手术组、胆碱50 mg/kg组、胆碱100 mg/kg组、胆碱200 mg/kg组、胆碱100 mg/kg+α7 n ACh R选择性阻断剂MLA1 mg/kg组、MLA 1 mg/kg组和阳性对照药尼莫地平20 mg/kg组。模型组和各给药组大鼠采用线栓法诱导右侧大脑中动脉永久性局灶性脑缺血,假手术组仅做血管分离,不插管,其余操作同手术组。所有药物用注射用水溶解,胆碱和尼莫地平口服给药,MLA采用皮下给药,给药量2 m L/kg,于手术后4 h给药,以后每天一次,连续给药10天。2.动物实验检测指标测定144只大鼠10天的生存率和体重;应用Bederson评分评估神经功能缺损;应用双前肢抓握实验和平衡木实验测定大鼠的行为学能力;p MCAO后10 d大鼠麻醉处死后迅速取脑,大脑冠状位切片应用TTC染色测定脑梗死体积;梗死侧大脑拍照后测定脑表面血管长度和面积用于观察缺血脑表面血管新生情况;脑石蜡切片HE染色观察病理形态学改变;切片经CD34免疫组化及CD34/PCNA免疫荧光染色观察大鼠缺血脑皮质微血管新生情况;测定血清NO和VEGF水平;Real-time PCR和Western blot检测缺血脑皮质α7n ACh R,HIF-1α,e NOS,i NOS和VEGF基因转录和蛋白表达水平。3.大鼠脑微血管内皮细胞的培养和鉴定取3周龄大鼠脑用改良胶原酶/分散酶消化法培养原代大鼠脑微血管内皮细胞。简单的说,将2～3周龄大鼠脑皮质剪碎、匀浆,然后先后通过200μm和77μm的滤网过滤,滤网上组织应用0.1%胶原酶/分散酶37°C消化25 min,沉淀中加入25%BSA-DMEM中1000×g,梯度离心20 min分离微血管层。分离的微血管加入完全DMEM培养基于37°培养于5%CO2培养箱中,完全培养基成分包括:20%FBS,100μg/m L内皮细胞生长因子,100μg/m L肝素钠,3.75 mg/m L HEPS,0.2 U/m L胰岛素,0.3 mg/m L L-谷氨酰胺,10U/m L青霉素和100μg/m L链霉素,p H 7.2–7.4。细胞应用CD34抗体免疫细胞化学法鉴定阳性,第三代细胞用于实验研究。4.细胞实验检测指标在低氧(1%O2、95%CO2)培养条件下,运用小干扰RNA技术(small-interfering-RNA,si RNA)沉默HIF-1α基因,应用MTS试剂盒检测胆碱对脑微血管内皮细胞的增殖作用;应用划痕实验检测胆碱对脑微血管内皮细胞的迁移作用;应用Matrigel基质胶使内皮细胞形成血管索,检测胆碱对脑微血管内皮细胞的成管作用影响;应用NO生化试剂盒和VEGF ELISA试剂盒检测细胞上清液NO和VEGF水平。细胞实验分组:对照组(无胆碱DMEM);胆碱1μM组;胆碱10μM组;胆碱100μM;胆碱100μM+MLA 1μM组;MLA 1μM组;胆碱10μM+HIF-1αsi RNA 100 nmol/L组。5.统计学方法所有数据用均数±标准差(mean±SD)表示,统计分析采用SPSS13.0统计分析软件,各组均数间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),组间两两比较采用Bonferroni’s检验,P<0.05作为差异有显著性。结果:第一部分胆碱对大鼠局灶性脑缺血的治疗作用及其血管新生机制1.胆碱增加p MCAO大鼠生存率,改善体重和神经功能大鼠p MCAO后10天,与假手术组相比,大鼠生存率降到60%。胆碱50～200 mg/kg给药10天,提高生存率到67%～80%,但是α7 n ACh R选择性阻断剂MLA 1 mg/kg能够阻断胆碱100 mg/kg的作用。大鼠p MCAO后10天,体重明显减轻,给予胆碱治疗后体重明显增加。应用Bederson评分连续10天评定大鼠神经功能缺损,模型组Bederson评分显著增加,100和200 mg/kg胆碱给药7～10天明显改善神经功能缺损;应用双侧前肢抓握和平衡木行走实验评定大鼠前肢肌力和感觉运动反射和协调能力,胆碱治疗可以剂量依赖性提高大鼠肌力,但是胆碱对大鼠平衡木行走实验评分没有显著改变;胆碱的这些作用能够被MLA所阻断。2.胆碱减少p MCAO大鼠脑梗死体积和神经细胞死亡大鼠p MCAO后10天,脑梗死体积明显增加;胆碱治疗10天,能够剂量依赖性降低脑梗死体积;但是胆碱的作用能够被MLA所完全阻断;在脑切片HE染色图像中,模型组大鼠可见许多死亡的神经细胞,同时伴有核固缩、肿胀和空泡化;胆碱能够显著改善这些病理学改变;MLA能够阻断胆碱的作用。3.胆碱促进缺血脑组织血管新生大鼠p MCAO后10天,检测胆碱对脑缺血表面和脑缺血组织半影区血管新生情况。与假手术组相比,模型组脑表面血管数量明显增加,胆碱能够剂量依赖性地促进p MCAO大鼠脑缺血组织血管新生,总的血管长度和血管面积与模型组相比显著性增加。CD34/PCNA免疫荧光双染显示新增殖的血管内皮细胞,代表微血管密度。与模型组相比,胆碱100mg/kg和200 mg/kg组CD34和PCNA共表达细胞数明显增加。MLA能够完全阻断胆碱对p MCAO大鼠缺血脑组织促血管新生作用。CD34免疫组化结果与之一致。尼莫地平和胆碱作用不一致,不能够促进缺血脑组织血管新生。4.胆碱提高p MCAO大鼠血清NO和VEGF水平pMCAO后10天,测定大鼠血清NO和VEGF水平。与假手术组比较,模型组血清NO水平明显降低,但是VEGF水平没有明显改变。100～200 mg/kg胆碱给药10天均能显著增加血清NO和VEGF的水平,这一作用能够被MLA所阻断。尼莫地平增加NO水平,但对VEGF水平没有明显影响。5.胆碱对p MCAO大鼠缺血脑皮质相关基因和蛋白的影响大鼠p MCAO后10天,应用Real-time PCR和Western blot检测缺血脑皮质相关基因和蛋白表达水平。与假手术组相比,模型组α7 n ACh R、HIF-1α和VEGF m RNA水平明显上调,然而e NOS m RNA显著下调,i NOS m RNA没有明显改变。100 mg/kg治疗10天显著增加α7n ACh R、HIF-1α、e NOS和VEGF m RNA水平,但是对i NOS基因没有明显改变。1 mg/kg MLA能够阻断胆碱的上述作用,但是其本身没有直接作用。各组α7 n ACh R、HIF-1α、e NOS、i NOS和VEGF蛋白表达水平结果与基因表达结果基本上一致。第二部分胆碱对低氧条件下r BMECs的影响1.胆碱促进r BMECs增殖、迁移和小管形成在1%的低氧条件下孵育24 h,与对照组相比,1～100μM胆碱能够浓度依赖性地促进r BMECs增殖,细胞迁移和血管索形成;1μM MLA和100 nmol/L HIF-1αsi RNA能够阻断10μM胆碱的上述作用,并且不产生直接作用,提示胆碱是通过激活α7 n ACh R上调HIF-1α表达促进r BMECs增殖、迁移和小管形成。2.胆碱增加r BMECs培养液中NO和VEGF水平低氧条件下,给药24 h后测定r BMECs培养上清液中NO和VEGF水平。与对照组相比,1～100μM胆碱能够浓度依赖性地提高NO和VEGF水平。MLA能够阻断胆碱促r BMECs分泌NO和VEGF;HIF-1αsi RNA能够阻断胆碱促r BMECs分泌VEGF但是对NO分泌无明显影响。提示胆碱促进r BMECs分泌VEGF与激活α7 n ACh R和HIF-1α同时相关;而促进NO分泌仅与激活α7 n ACh R相关。结论:1.胆碱通过激活α7 n ACh R促进p MCAO大鼠缺血脑组织血管新生,形成侧枝循环,从而提高大鼠生存率,减少脑梗死体积,改善体重和神经行为学功能。2.胆碱治疗大鼠缺血性脑卒中的血管新生作用与上调脑组织α7 n ACh R,HIF-1α,e NOS和VEGF m RNA和蛋白表达,提高血清VEGF和NO水平有关。3.胆碱在低氧诱导下通过激活α7 n ACh R促进r BMECs增殖、迁移、成管作用和分泌VEGF、NO,可能是其促缺血性脑血管新生的细胞学机制。4.激活α7 nAChR通路促进脑血管新生可能是缺血性脑卒中治疗的新途径。