论文部分内容阅读
目的:IgA肾病（IgA nephropathy,IgAN）,是一种以肾小球系膜区IgA沉积,同时伴有系膜细胞增生和系膜基质扩张为主要病理改变的原发免疫性肾小球肾炎。主要临床表现为血尿,并伴有不同程度的蛋白尿、高血压和肾功能受损等,是导致终末期肾衰竭（ESRD）的重要病因。免疫炎症损伤是IgAN发生发展的主导因素。在IgAN中,NF-κB/NLRP3通路处于激活状态,抑制该通路将有效改善IgAN。研究表明,外泌体作为一种细胞通讯信使参与多种肾脏疾病的治疗,对慢性肾病的发生发展起着重要的调控作用。青蒿素（Artemisinin,ART）是黄花蒿干燥地上部分的有效物质,羟基氯喹（Hydroxychloroquine,HCQ）是由4-氨基喹啉化合物构成的硫酸羟氯喹,两药均具有抗炎、免疫抑制或调节作用。前期研究发现,联合应用青蒿素与羟基氯喹（AH）发挥增效减毒的优势,并对IgAN具有良好的治疗作用。但AH对IgAN的作用机制尚不清楚,故本研究以外泌体介导NF-KB/NLRP3通路为切入点,探讨在IgAN中外泌体与NF-κB/NLRP3通路的内在联系及AH的干预作用。在体建立IgAN大鼠模型,观察AH对IgAN的治疗作用及潜在机制;体外培养人肾小管上皮细胞（HK-2）,观察AH对肾小管上皮细胞中外泌体分泌的影响,并进一步共培养人肾小管上皮细胞与系膜细胞（HMC）,观察外泌体对系膜细胞增殖的调控作用,深入探讨AH治疗IgAN的作用是否与外泌体介导NF-KB/NLRP3通路有关。方法:1 AH对IgAN大鼠的治疗作用及对外泌体介导NF-KB/NLRP3的调控作用SPF级雄性Sprague-Dawley大鼠90只,自由饮食喂养一周后,随机选取10只作为正常对照组,其余各组大鼠均采用600 mg/kg小牛血清白蛋白（BSA）+脂多糖（LPS）+四氯化碳（CC14）的方法建立IgAN模型,而空白对照组饮用同体积蒸馏水。以24 h尿蛋白含量及镜下血尿作为大鼠模型成功的指标。模型成功后,将大鼠随机分为模型组、地塞米松组（0.078 mg/kg）、青蒿素组（33.33 mg/kg）、羟基氯喹组（33.33 mg/kg）、AH 低剂量组（16.66 mg/kg）、AH 中剂量组（33.33 mg/kg）、AH 高剂量组（66.66 mg/kg）、外泌体组（7.5 mg/kg）,持续给药4周,空白对照组与模型组给予同体积蒸馏水。①以大鼠24 h尿蛋白,尿红细胞;血液生化指标:血肌酐、尿素氮、总胆固醇、甘油三酯、白蛋白、总蛋白、谷丙转氨酶及谷草转氨酶的含量;ELISA检测肾脏组织中炎症因子IL-4、IL-17的含量;脏器指数;肾组织病理形态学H&E染色检测及PAS染色检测评价AH的药效;以透射电镜检测肾小球系膜区电子致密物的沉积与基底膜厚度;免疫荧光检测IgG、IgA、C3在肾小球的沉积;外泌体CD63在肾小球中的表达评价AH对IgAN的治疗作用。②采用Western blot技术检测肾脏组织外泌体标记蛋白CD81及NF-κB/NLRP3炎症小体相关蛋白 p65,p-p65,ASC,IκB-α,NLRP3、caspase-1 和 IL-1β 的表达水平。2 AH对肾小管上皮细胞外泌体的干预作用及介导外泌体对系膜细胞NF-κB/NLRP3的调控作用2.1 AH对肾小管上皮细胞中外泌体分泌的影响体外培养肾小管上皮细胞（HK-2）,采用1.25μg/mL LPS刺激HK-2细胞24 h建立HK-2细胞炎症损伤模型,设立组别为:空白组（完全培养基DEMEF12）、模型组（1.25μg/mLLPS）、青蒿素组（0.5μM ART+1.25μg/mL LPS）、羟基氯喹组（1.5μM HCQ+1.25 μg/mLLPS）、AH 低浓度组（0.5:1.5μMAH+1.25μg/mL LPS）、AH 高浓度组（1:3μMAH+1.25μg/mLLPS）,给药干预24 h。①MTT检测细胞活力,筛选药物最佳浓度。②免疫荧光检测细胞外泌体CD63的表达情况。③Western blot检测HK-2细胞上清及裂解液中外泌体标记蛋白CD63、CD9或CD81的表达情况。④透射电镜（TEM）技术鉴定HK-2细胞上清中分泌的外泌体形态,以及联用NanoFCM Flow NanoAnalyzer检测外泌体粒径大小和浓度,准确考察AH对HK-2细胞外泌体的分泌作用。2.2 AH介导外泌体对系膜细胞中NF-κB/NLRP3炎症小体的调控作用体外将肾小管上皮细胞（HK-2）与系膜细胞（HMC）通过Transwell进行共培养,上层小室培养HK-2细胞,下层培养HMC细胞。采用1.25μg/mL LPS刺激HK-2细胞24 h建立HK-2细胞炎症损伤模型,设立组别为:空白组（完全培养基DEME F12）、模型组（1.25 μg/mL LPS）、青蒿素组（0.5 μM ART+1.25μg/mL LPS）、羟基氯喹组（1.5μM HCQ+1.25μg/mL LPS）、AH 低浓度组（0.5:1.5μM AH+1.25μg/mL LPS）、AH 高浓度组（1:3μMAH+1.25μg/mLLPS）。另外,HMC 细胞应用 20μg/mLLPS 刺激 24h建立HMC细胞中NLRP3炎症小体活化模型,给药干预24 h,考察HK-2细胞外泌体对HMC中NLRP3炎症小体活化的影响。①DiO标记HK-2细胞外泌体,免疫荧光检测HMC细胞摄取的外泌体情况及共定位检测HMC细胞中CD63的表达水平。②Western blot检测HMC细胞中NF-κB/NLRP3炎症小体相关蛋白p65,p-p65,ASC,IκB-α,NLRP3、caspase-1和IL-1β的表达。2.3抑制HK-2细胞外泌体分泌,研究AH对HMC中NF-κB/NLRP3炎症小体的调控作用体外培养HK-2细胞,采用不同浓度的外泌体抑制剂GW4869刺激HK-2细胞外泌体分泌,设立组别为:空白组（完全培养基DEME F12）、模型组（1.25μg/mLLPS）、2.5μM GW4869（2.5 μM GW+1.25μg/mL LPS）、5μM GW4869（5μM GW+1.25μg/mL LPS）、10μM GW4869（10μM GW+1.25 μg/mL LPS）、20μM GW4869（20 μM GW+1.25μg/mL LPS）、40 μM GW4869（40μM GW+1.25μg/mL LPS）、80μM GW4869（80 μM GW+1.25μg/mL LPS）,干预 24 h。另外,将HK-2细胞与HMC细胞通过Transwell进行共培养,上层小室培养HK-2细胞,下层培养HMC细胞。采用40μM外泌体抑制剂GW4869抑制HK-2细胞外泌体分泌。设立组别为:空白组（完全培养基DEME F12）、模型组（1.25μg/mLLPS）、青蒿素组（0.5 μM ART+1.25μg/mL LPS）、羟基氯喹组（1.5μM HCQ+1.25μg/mL LPS）、AH 低浓度组（0.5:1.5μM AH+1.25μg/mL LPS）、AH 高浓度组（1:3μM AH+1.25μg/mL LPS）、GW4869组（40μM GW+1.25 μg/mL LPS）、GW4869+AH组（40μM GW+0.5:1.5μM AH+1.25μg/mLLPS）。同时,HMC 细胞应用 20μg/mL LPS 刺激 24 h 建立 HMC细胞中NLRP3炎症小体活化模型,给药干预24 h。①Western blot检测HK-2细胞上清及裂解液中外泌体CD9、CD63的表达水平,筛选GW4869对HK-2细胞中外泌体的最佳抑制浓度。②Western blot检测HMC细胞中NF-κB/NLRP3炎症小体相关蛋白p65,p-p65,ASC,IκB-α,NLRP3、caspase-1和IL-1β的表达。结果:1 AH对IgAN大鼠的治疗作用及对外泌体介导NF-κB/NLRP3的调控作用①体内实验结果表明,与IgAN模型组相比,AH可以有效改善肾脏病理损伤,降低大鼠24 h尿蛋白含量以及尿红细胞水平,降低肌酐、尿素氮、甘油三酯、总胆固醇水平,增强白蛋白、总蛋白表达。减少肾组织中炎症因子IL-4、IL-17表达。肾脏病理结果显示AH可减轻肾组织损伤,减轻肾小球基底膜扩张、系膜区增生及免疫复合物沉积。免疫荧光结果表明,与模型组比较,AH显著降低IgA、IgG、C3在肾小球的沉积,增强外泌体CD63在肾小球中的表达。透射电镜结果显示,AH明显抑制肾小球系膜区电子致密物的沉积,并使系膜基底膜增厚。综上结果均显示,发现相比单用ART或HCQ,AH合用对IgAN的疗效更显著。②Western blot结果显示,IgAN模型组,肾脏组织外泌体CD81表达上升;NF-κB/NLRP3信号通路被激活,NF-κB相关蛋白磷酸化p65,ASC,IκB-α的表达升高,NLRP3、caspase-1和IL-1β的表达水平上升。AH可以显著增强外泌体分泌,抑制NF-KB/NLRP3炎症小体活化。2 AH对肾小管上皮细胞外泌体的干预作用及介导外泌体对系膜细胞NF-κB/NLRP3的调控作用①HK-2细胞实验中,免疫荧光结果显示LPS使HK-2外泌体CD63的表达上升,而AH进一步增强外泌体的分泌。透射电镜（TEM）联用纳米流式（NanoFCM）结果表明,相比空白组,LPS使外泌体分泌增加;同LPS组比较,AH进一步促进外泌体分泌,并改变了外泌体外观形态。因此推测,AH可能使外泌体中某种成分发生改变而发挥抗炎作用。②HK-2细胞与HMC细胞共培养发现,免疫荧光结果显示AH显著促进HK-2细胞外泌体分泌,并被HMC充分摄取。Western blot结果显示,AH促进分泌HK-2细胞中的外泌体能显著抑制HMC细胞中NF-κB相关蛋白p-p65,IκB,ASC表达,同时抑制了 NLRP3炎症小体活化,降低相关蛋白IL-1β,caspase-1的表达。③Western blot结果表明,GW4869显著抑制外泌体分泌,显著降低AH对p-p65,NLRP3,caspase-1蛋白以及IL-1β表达的抑制作用。表明,AH通过介导外泌体分泌抑制NF-κB/NLRP3炎症小体活化通路,从而发挥抗炎作用,干预治疗IgAN。结论:AH对IgAN具有良好的治疗效果,能够显著降低IgAN大鼠24 h尿蛋白及血尿的产生;降低血清中肌酐、尿素氮、总胆固醇及甘油三酯的表达,升高白蛋白与总蛋白的表达;减少肾组织中炎症因子IL-4与IL-17的产生,改善并提高肾功能。AH可以显著减轻肾脏病理损伤,抑制肾小球系膜基质扩张,系膜细胞增生;其作用机制可能是通过促进外泌体的分泌抑制NF-κB/NLRP3炎症小体活化,从而达到保护肾组织,改善肾损伤的目的。