背景非酒精性脂肪肝（NAFLD）是最常见的慢性肝病,也是导致肝硬化、肝癌相关死亡的主要原因之一,NAFLD根据病理可分为:单纯性脂肪变性（SS）、非酒精性脂肪肝炎（NASH）、NASH相关性肝硬化。NAFLD的发病机制尚未完全阐明。脂质代谢紊乱贯穿着NAFLD发病的始终,长链脂酰Co A合成酶1（ACSL1）能催化C:12-C:22之间的长链脂肪酸合成脂酰Co A,无论是脂质的合成还是分解代谢均与ACSL1密切相关。在前期的动物实验中,本课题组基于转录组学发现正常对照组与高脂饲料喂养NAFLD大鼠肝组织的ACSL1 m RNA表达下调（N=3,log2Fold Change=-0.415,Pvalue=0.00063586,实验数据尚未正式发表）,在预实验中,WB也进一步验证了大鼠肝组织ACSL1蛋白表达量的下调。进一步根据生物信息学,我们对ACSL1进行单基因集富集分析（GSEA）发现ACSL1低表达与花生四烯酸代谢相关,ACSL1可能是治疗NAFLD的有效干预靶点。但是ACSL1在NAFLD中的发病机制仍需进一步研究。虽然饮食控制和运动可以改善NAFLD,但对于严重的NAFLD患者,需要有效的降脂治疗才能重新获得健康的血脂水平。临床常用的降血脂的药物主要包括他汀类与贝特类药物,但是此类药物价格昂贵,且长期服用会出现胃肠道反应及肌痛、横纹肌溶解等不良反应。因此选择一种有效、安全、便宜的药物对于高血脂、冠心病、NAFLD患者有重要意义。本课题组前期的实验发现黄芪-葛根药对具有保护胃黏膜损伤的作用,且配伍广陈皮具有协同增效作用,因此本课题组多年致力于芪葛汤（黄芪:葛根:广陈皮=30:10:5）的药理研究。在前期我们发现预给药能预防酒精性肝损伤,还能改善酒精性肝损伤大鼠的甘油磷脂代谢、色氨酸代谢、花生四烯酸等脂质代谢产物,芪葛汤可能具有调脂的作用。我们进一步发现芪葛汤能降低高脂饮食+四氯化碳（分子式:CCL4）诱导NAFLD大鼠的胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）。大鼠的肝脏、尿液代谢组学发现芪葛汤能降低油酸、亚油酸、二十二碳五烯酸、甘油磷脂等脂质代谢产物（相关数据尚未正式发表,2020年广州中医药大学彭冲博士学位论文）。而亚油酸是体内的必需脂肪酸,可以代谢为花生四烯酸。因此芪葛汤可能通过调节花生四烯酸改善NAFLD的脂质紊乱。本实验进一步研究芪葛汤改善NAFLD的机制,为芪葛汤在临床上的应用提供理论依据。目的1、研究ACSL1在调控花生四烯酸代谢在NAFLD中的发病机制;2、研究芪葛汤及其有效成分干预NAFLD的体内体外的机制。方法第一部分:ACSL1在NAFLD中的发病机制研究。（1）利用生物信息学研究ACSL1在NAFLD中的发病机制研究:在GEO在线数据库下载NAFLD高通量数据及基因芯片数据。利用R语言中的limma包、edge R包对基因数据集进行分析,明确ACSL1在NAFLD中的差异变化,并利用数据集进行ACSL1的单基因集富集分析（GSEA）。（2）体内研究:在体内利用高脂高胆固醇饲料构建SS模型,高脂高胆固醇饲料+CCL4构建NASH模型,记录大鼠的体重,HE及油红染色明确大鼠肝脏肝脂质堆积情况。全自动生化仪检测大鼠血清肝功两项（ALT、AST）及血脂4项（TC、TG、HDL、LDL）,WB、免疫组化验证相关蛋白ACSL1、FADS2、CYB5R3、COX1、SCD、ELOVL6、CYB5的表达变化。（3）体外研究:首先在体外利用300μM油酸+150μM棕榈酸+100μM亚油酸（OPL）干预大鼠BRL细胞构建NAFLD模型,甲醇与氯仿抽提细胞脂质,全自动生化仪检测细胞内TG的含量,并结合油红染色,评价模型的构建,蛋白质免疫印迹（WB）明确ACSL1在NAFLD中的表达趋势。下一步,在体外利用慢病毒构建ACSL1过表达（Over ACSL1）和下调（sh ACSL1）的体外模型,WB和免疫荧光评价模型的构建,并进一步,利用LC-MS/MS分析脂肪酸干预的control、sh ACSL1、Over ACSL1的脂质组学变化,最后利用WB、免疫共沉淀（CO-IP）验证相关蛋白的表达及蛋白互作。第二部分:芪葛汤及其有效成分干预NAFLD的体内体外的机制研究。（1）体内研究:在体内利用高脂高胆固醇饲料构建SS模型,高脂高胆固醇饲料+CCL4构建NASH模型。予SS模型大鼠低（5g/kg）、中（10g/kg）、高（20g/kg）剂量芪葛汤灌胃。由于在前述SS模型中,已经筛选5g/kg芪葛汤为干预NAFLD大鼠的有效剂量,故予NASH大鼠5g/kg芪葛汤灌胃。记录大鼠的体重。HE及油红染色明确大鼠肝脏肝脂质堆积情况。全自动生化仪检测大鼠血清肝功两项（ALT、AST）及血脂4项（TC、TG、HDL、LDL）,WB、免疫组化验证相关蛋白ACSL1、FADS2、CYB5R3、COX1、SCD、ELOVL6、CYB5的表达变化。（2）体外研究:筛选黄芪甲苷、葛根素、川陈皮素、3’-羟基葛根素、毛蕊异黄酮、柚皮素、槲皮素7个芪葛汤的有效成分进行体外的初筛实验,首先利用MTT实验明确7个成分在体外的无毒性浓度,进一步使用有效成分干预OPL培养的大鼠BRL细胞,分别经甲醇与氯仿、异丙醇抽提脂质,全自动生化仪检测TG及油红染色评价有效成分对BRL细胞脂质堆积的影响。结果第一部分:ACSL1在NAFLD中的发病机制研究。（1）基于生物信息学研究ACSL1在NAFLD中的差异变化:在GEO数据库中,共下载4组NAFLD的数据集,其中ACSL1在GSE33814、GSE39140中表达下调,在GSE89632、GSE126848无明显差异,GSEA分析表明:ACSL1高表达与过氧化物酶体、脂肪因子信号通路相关,而ACSL1低表达与花生四烯酸代谢相关。（2）体内研究:在体内成功构建SS、NASH模型。对于SS大鼠,与正常对照组（Control）相比,模型组大鼠在第15天呈缓慢增长趋势,第20天体重显著降低,而HE染色提示正常组大鼠肝细胞质地较紧密,SS大鼠肝脏肝小叶正常,肝细胞空泡形成,无明显炎症细胞浸润。油红染色则提示SS中堆积着大量中性脂滴。与Control组相比,SS组ALT、AST无明显变化,TC、TG、LDL显著升高,HDL下降。WB则提示:与Control相比,模型组ACSL1显著降低,而FADS2、CYB5R3、COX1显著升高。SCD、ELOVL6、CYB5两组之间无统计学意义,免疫组化结果显示:与正常对照组相比,模型组的ACSL1表达量下调,而FADS2、ELOVL6、COX1、LOX5表达增高,而SCD则无明显统计学差异。对于NASH大鼠,第30天,与Control组相比,NASH大鼠体重低于正常对照组大鼠。ALT、AST、TC、TG、LDL显著升高,HDL下降,HE染色提示NASH大鼠肝脏大泡性脂肪变性,小叶炎症浸润,肝细胞气球样变性。油红染色则提示NASH中堆积着大量中性脂肪。WB表明:与正常对照组相比,NASH组ACSL1显著降低,而SCD、ELOVL6、CYB5、COX1、LOX5显著升高,FADS2、CYB5R3两组之间无统计学意义。（3）体外研究:300μM油酸+150μM棕榈酸+100μM亚油酸（OPL）干预大鼠BRL1天后,细胞胞内TG明显增高,油红染色提示细胞内存在大量中性脂肪,WB提示伴有ACSL1的降低。WB和免疫荧光提示成功在体外构建ACSL1过表达及下调模型。脂质组学提示:Control与model组比较,共获得154个下调、519个上调的代谢物,OPL-BRL及OPL-sh ACSL1组有共获的195个下调的代谢物,357个上调的代谢物,PL-BRL及OPL-Over ACSL1两组之间共获得158个下调,322个上调的差异代谢。差异代谢物富集分析提示:ACSL1下调与花生四烯酸代谢密切相关。验证实验发现:OPL-BRL与OPL-sh ACSL1组比较,FADS2、SCD下调、ELOVL6、COX1、LOX5上升。ACSL1与COX1、CYB5及CYB5R3未发现相互作用关系。第二部分:芪葛汤及其有效成分干预NAFLD的体内体外的研究。（1）体内研究:对于SS大鼠,与control组相比,模型组大鼠前2周体重明显增加,后大鼠增长速度缓慢,第20天模型组大鼠体重与对照组相比较明显减轻。与模型组相比,5g/kg芪葛汤大鼠体重降低。HE染色提示:正常组肝小叶中央静脉周围肝板结构排列整齐,模型组可见肝细胞肿胀,并可见大小不等的空泡,伴核移位现象。5g/kg芪葛汤组可见肝细胞肿胀,肝细胞中由大小不等的小空泡,核移位现象不明显。血清生化提示:与模型组相比,5g/kg芪葛汤能显著降低大鼠的TC、TG及LDL。10g/kg芪葛汤及20g/kg芪葛汤组病理及生化未见明显改善。WB提示:与正常组相比,模型组ACSL1表达量下调。而与模型组相比,5g/kg芪葛汤与阳性药的ACSL1表达量上调。与正常组相比,模型组FADS2、CYB5R3、COX1表达量上调。而与模型组相比,5g/kg芪葛汤组FADS2、CYB5R3、COX1表达量降低,免疫组化证实进一步佐证了WB的结果。对于NASH大鼠,HE染色提示NASH大鼠肝脏大泡性脂肪变性,小叶炎症浸润,肝细胞气球样变性。5g/kg芪葛汤组炎症浸润减轻,肝细胞仍有空泡样变性,油红染色则提示NASH中堆积着大量中性脂肪,5g/kg芪葛汤脂质堆积较模型组减少。血清生化提示:与正常组相比,模型组ALT、AST、TC、TG、LDL均显著升高,HDL下降,而5g/kg芪葛汤组可以显著下降NASH大鼠的ALT、AST、TC、LDL,但对TG及HDL无明显变化。WB提示:5g/kg芪葛汤可以提高NASH大鼠的ACSL1的表达,降低SCD、CYB5R3、CYB5、LOX5的表达（2）体外研究:氯仿与甲醇抽提脂质发现100μM黄芪甲苷、1m M葛根素、40μM川陈皮素、100μM柚皮素能降低肝细胞TG含量,而异丙醇抽提发现100μM黄芪甲苷、40μM川陈皮素、100μM柚皮素、20μM槲皮素能降低肝细胞TG含量,有效成分干预细胞后,经固定后,油红染色提示模型组细胞大量脂质堆积,而黄芪甲苷,川陈皮素、柚皮素的脂质堆积稍有减少,其它组则改善不明显。结论:（1）下调ACSL1可以促进花生四烯酸的生成和代谢,导致肝脏脂质代谢的紊乱和诱导肝脏炎症的发生。其可能的机制是通过上调FADS2、SCD、LOX5、COX1等与花生四烯酸代谢相关蛋白的表达。（2）芪葛汤在体内可以改善SS和NASH大鼠的脂质堆积和炎症反应,其可能的机制是通过上调ACSL1的表达,改善肝脏花生四烯酸代谢。（3）芪葛汤有效成分黄芪甲苷、川陈皮素、柚皮素能降低BRL大鼠肝细胞脂质堆积。