几种昆虫相关细菌的多样性及抗菌和除草活性物质的挖掘

来源 :安徽农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:fantasy1998
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昆虫是世界上最多样化的动物类群,其丰富的多样性意味着昆虫共生菌的多样性。但与昆虫共生菌的多样性相比,人们对这类特殊生物环境中微生物的研究仍然不多,对它们的活性次级代谢产物的研究就更少了。本论文使用扩增子测序技术调查了东亚飞蝗肠道和白蚁巢相关细菌的菌群组成,进一步分别以东亚飞蝗肠道细菌DYFHCD-18、黑翅土白蚁巢相关的两株细菌YC-9和YT1-1、美洲大蠊肠道共生细菌W14为研究对象,通过薄层层析、硅胶柱层析和LH-20葡聚糖凝胶层析等分离技术对上述4种细菌的次级代谢产物进行分离,利用1D-NMR、2D-NMR及HR-ESI-MS等技术对上述分离得到的化合物进行结构鉴定,共得到28个化合物,鉴定出26个化合物,其中2个为新化合物。对已分离得到的部分化合物进一步做了抗菌和除草活性的测试。具体结果如下:1.16S rDNA扩增子测序分析发现东亚飞蝗感染球孢白僵菌后肠道内的菌群多样性结构发生显著变化,病菌感染后肠道细菌魏斯氏菌属(Weissella)显著降低,但乳球菌属(Lactococcus)、哈夫尼亚-肥杆菌属(Hafnia-Obesumbacterium)、肠球菌属(Enterococcus)和沙雷氏菌属(Serratia)显著升高。从东亚飞蝗肠道中分离到1株对白僵菌有抗菌活性的菌株DYFHCD-18,经鉴定为Pseudomonas aeruginosa,进一步从P.aeruginosa DYFHCD-18中分离得到15个化合物,鉴定出13个已知化合物(1-13),包括pyoluteorin(1)、phenylacetic acid(2)、cyclo(L-Phe-trans-4-OH-L-Pro)(3)、3-indolylacetic acid(4)、2-heptyl-3-hydroxy-4(1H)quinolone(5)、(E)-2-non-1-en-1-yl-4(1H)quinolone(6)、2-n-Octyl-4-hydroxyquinoline(7)、cyclo-(L-Pro-L-Leu)(8)、cyclo-(4-hydroxyl-S-Pro-S-Leu)(9)、dirhamnolipid(10)、O-aminoacetophenone(11)、1-hydroxyphenazine(12)、carisphthalate(13)。活性测试发现:化合物1对烟草疫霉病菌的菌丝生长具有很强的抗真菌活性,抑制活性的IC50值为4.0μg/m L,与阳性对照放线菌酮的活性相当(IC50=3.8μg/m L);在50μg/m L浓度下,化合物4和12对烟草疫霉病菌孢子萌发有明显抑制作用,抑制率分别为98.2%和85.2%;在30μg/6mm disc的条件下,化合物1对四联球菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌具有很强的抑制活性,其抑菌圈分别为39.5、33.8、26.2和24.7 mm,比阳性对照硫酸庆大霉素的活性好;化合物1对稗草根具有较好的抑制活性,抑制活性的IC50值为11.9μg/m L。进一步对DYFHCD-18进行全基因组测序分析,共注释到18个次级代谢产物基因簇,其中合成pyoverdin、pyocyanine、oxalomycin B、lankacidin C的基因簇比对相似度低,具有一定的挖掘价值。2.16S rDNA扩增子测序技术分析结果表明:白蚁巢相关细菌分属于77个门,168个纲,330个目,472个科和760个属;细菌多样性分析表明芽孢杆菌属(Bacillus)和粘球菌科(Myxococcaceae)在白蚁巢内均具有较高的丰度。进一步从黑翅土白蚁巢中分离得到2株细菌,分别鉴定为Bacillus siamensis YC-9和Myxococcus stipitatus YT1-1。从B.siamensis YC-9中分离并鉴定得到5个已知化合物(14-18),包括hexadecanoic(14)、cyclo(Gly-D-Phe)(15)、cyclo(L-trans-Hyp-L-Leu)(16)、C15-surfactin(17)和macrolactin A(18);活性测试发现:在50μg/m L的浓度下,化合物14-18对黄瓜枯萎病菌孢子萌发具有一定的抑制活性,抑制率分别为35.4%、7.3%、18.4%、100%和61.1%,其中活性最好的17对黄瓜枯萎病菌孢子半数萌发抑制IC50值为5.1μg/m L,与阳性对照放线菌酮活性相当(IC50=2.6μg/m L);在30μg/6mm disc的条件下,化合物17对四联球菌有较弱抑制活性,抑菌圈直径为10.2 mm,低于阳性对照硫酸庆大霉素(33.8 mm)。对YC-9进行全基因组测序分析,共注释到17个次级代谢产物基因簇,其中合成butirosin A/butirosin B、surfactin、rhizocticin、plipastatin、surfactin、fengycin的基因簇比对结果相似度较低,具有一定的挖掘价值。活性测试表明菌株M.stipitatus YT1-1对小麦纹枯病菌具有很强的抑制活性,且对稗草根也具有很强的抑制活性;进一步从YT1-1中分离并鉴定得到1个新化合物myxocostipe A(19)和1个已知化合物cyclo-(Leu-Tyr)(20);活性测试发现:在50μg/m L的浓度下,myxocostipe A对黄瓜枯萎病菌孢子萌发具有一定的抑制活性,抑制率为45.7%。3.从美洲大蠊肠道细菌Brevibacterium epidermidis W14中分离并鉴定出6个单体化合物(21-26),其中breviepider A(21)为新化合物,已知物包括cyclo(L-Pro-L-Leu)(22)、bis(2-ethylhexyl)、Benzene-1,2-dicarboxylate(23)、2,7-Dimethyl-5,10-butenophenazine-11,14-dione(24)、cyclo[L-(4-hydroxyprolinyl)-L-leucine](25)和cyclo(L-Pro-Gly)(26)。在50μg/m L的浓度下,化合物21、22和26对黄瓜枯萎病菌孢子萌发具有一定的抑制活性,抑制率分别为25.3%、5.1%、和53.6%。上述研究结果表明,昆虫相关细菌作为一类研究较少的特境微生物,是新颖活性天然产物的重要来源,值得进一步研究。
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