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研究背景腹膜透析(peritoneal dialysis,PD)是肾病末期进行一体化治疗的方式之一,操作简便,经济负担较轻,治疗时间灵活,并且能有效保护残存的肾功能,已逐渐成为大多数终末期肾病患者(End-stage renal disease,ESRD)的首选。腹膜间皮细胞(peritoneal mesothelial cells,PMCs)是在PD过程中发挥主要作用的细胞,但腹膜长期与非生理的高糖透析液接触,高糖环境损害了PMCs,引起腹膜结构及功能的异常,并出现炎性细胞的大量增殖,最终通过一系列病理生理改变致使发生腹膜纤维化(Peritoeneal Fibrosis,PF),引起滤过功能持续下降直至衰竭,这也成为腹膜透析的患者退出腹透的主要原因,大大降低终末期肾脏病患者的生存质量。Sonic hedgehog(Shh)信号转导通路是一组在正常生长发育过程中广泛表达、用来调节细胞生长的基因,生理状态下管控器官的起源与发育,主要通过级联反应调控下游核转录因子Gli1、Gli2、Gli3基因的表达,其中Gli1位于Hedgehog信号通路最末端,只有转录激活的功能,所以认为Gli1的表达水平直接反映了Hedgehog信号通路的活性状态。在正常发育过程中,Shh信号通路处于一种低活性的状态,但某些病理因素刺激后可出现再活化。现有的研究多集中在Shh通路在肝肺及肾脏等脏器纤维化中的作用,有关Shh通路在腹膜上的表达鲜有报道。本例研究旨在通过建立大鼠模型,探究Shh信号通路在PMCs的上皮-间质转分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)中的潜在作用,并探讨阻断Shh信号转导通路的激活,能否避免腹膜的损伤,从而提高长期腹膜透析的疗效,为临床上减少EMT及防治腹膜纤维化提出新思路。研究方法1.利用胰酶消化法原代培养大鼠腹膜间皮细胞(rat peritoneal mesothelial cells,RPMCs),并应用免疫组织化学技术方法鉴定培养出的RPMCs。2.应用免疫印迹试验(Western blot)以及逆转录聚合酶链反应(reversetranscription-polymerase chain reaction,RT-PCR)测定培养细胞中Shh、GLi1的蛋白质及mRNA的表达,观察高糖环境刺激对RPMCs中Shh及GLi1表达的影响。3.应用不同剂量的Shh信号通路拮抗剂-环杷明(cyclopamine,CPN)干预后,通过Western blot法和RT-PCR法检测RPMCs中的Shh、GLi1以及纤维化相关标志物α-SMA等的表达情况,观察阻断Shh信号通路的表达给高糖诱导的大鼠腹膜间皮细胞纤维化带来的影响。实验结果1.RPMCs的培养及鉴定倒置光镜下可见培养出的细胞融合后是一种不规则的多边形,类似于鹅卵石的形状,免疫组化后可表达细胞角蛋白及波状蛋白,不能表达第Ⅷ因子相关抗原及白细胞CD45抗原,与文献记载PMCs表型一致,鉴定为RPMCs。2.高浓度的葡萄糖作用下,Shh和GLi1在RPMCs中的表达以时间及剂量依赖方式显著增加应用浓度为2.5%的葡萄糖培养液分别刺激RPMCs不同时间后,应用RT-PCR和Western blot法检测Shh、Gli1的mRNA及蛋白质的表达,发现与对照组相比,高糖组的表达呈现出明显的随时间增加而增长的趋势,时间越久,增长幅度越明显(P<0.05)。而在同样的作用时间下(24小时),分别用葡萄糖浓度5.4mmol/L、83.3mmol/L(1.5%)、150.0mmol/L(2.5%)、236.1mmol/L(4.25%)的培养液同样方式刺激RPMCs后,与对照组相比,高糖组RPMCs中Shh和Gli1mRNA及蛋白质的表达也明显增多,且所用的葡萄糖浓度越高,增多的越显著(P<0.05),呈现出剂量依赖性。3.CPN可以抑制高糖诱导RPMCs的Shh信号通路,同时伴有PMCs纤维化因子的表达下降。用不同浓度的CPN(2.5uM,5uM)分别预处理RPMCs,然后均用2.5%葡萄糖孵育24小时,之后通过RT-PCR和Western blot法研究发现,CPN不能抑制Shh的mRNA和蛋白质表达,但Gli1的mRNA和蛋白质表达较高糖组却有明显下降,这说明CPN有效地阻断了Shh的信号转导(P<0.05);CPN阻断Shh信号通路后,与单纯高糖组比较,RPMCs中相关纤维化因子α-SMA等的表达下降,E-cadherin的表达增加,并且这一作用呈现出剂量依赖的趋势。结论1.高糖以剂量和时间依赖的方式诱导大鼠腹膜间皮细胞Shh信号通路的活化;2.Shh信号通路的抑制剂环杷明可抑制高糖诱导的大鼠Shh信号通路的活化。3.环杷明以剂量依赖的方式使α-SMA、collagern1、fibronectin的表达下降,E-cadherin的表达增强;从而有效地抑制高糖诱导大鼠腹膜间皮细胞的EMT,延缓腹膜纤维化进展。