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酵母细胞和哺乳动物细胞的N-糖基化途径存在一定的相似性,但最终形成的糖蛋白上N-糖链类型却存在极大的差异。为了构建酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)医药糖蛋白表达系统,必须对其N-糖基化途径进行人源化改造。本文以酿酒酵母W303a菌株为出发菌株利用基因工程手段敲除其N-糖基化修饰过程的关键基因,并主要对酿酒酵母N-糖基化途径改造过程中出现的菌株细胞壁缺陷、生长速度缓慢、N-糖基化效果降低等问题进行研究。主要研究成果如下:(1)在Δalg3Δoch1菌株中过量表达酿酒酵母的RHO1基因并对菌株的生长状况、细胞壁缺陷的回补和N-糖基化修饰效果等方面进行研究。结果表明,过量表达RHO1后Δalg3Δoch1菌株的细胞壁β-1,3-葡聚糖层和甘露糖蛋白层变厚、细胞絮凝状况降低、生长速度得到提高、对外部环境的耐受性增强。RHO1基因的过量表达还可显著提高Δalg3Δoch1菌株中液泡羧肽酶Y和外源分泌蛋白人类溶菌酶的N-聚糖位点占有率。此外,细胞壁N-糖链结构分析和蛋白分泌效果等研究结果表明,RHO1的过量表达并不会影响Δalg3Δoch1菌株的细胞壁N-糖链的结构组成且可显著的提高菌株的蛋白分泌效率。(2)对Δalg3Δoch1Δmnn1菌株进行适应性进化得到生长状况部分恢复的菌株,并对进化后菌株相关性质恢复的原因进行研究。OST亚基和ALG家族基因表达量的分析结果表明,进化后的Δalg3Δoch1Δmnn1菌株相关性质的回补与此类基因的调控密切相关。以其中的ALG6和WBP1基因为研究对象。研究结果表明,在未适应性进化的Δalg3Δoch1Δmnn1菌株中过量表达ALG6和WBP1基因可显著的提高菌株的生长速度、改善菌株对外部环境的耐受性。ALG6或WBP1基因的过量表达均可显著提高Δalg3Δoch1Δmnn1菌株中液泡羧肽酶Y的N-聚糖位点占有率。ALG6基因的过量表达还可显著提高Δalg3Δoch1Δmnn1菌株对外源分泌蛋白人类溶菌酶的分泌效果。