研究背景:　　中性粒细胞是固有免疫系统的前沿防线。除经典的趋化、调理、吞噬和清除作用外，中性粒细胞还存在着另一套极为重要的限制和杀灭病原体的方法，即中性粒细胞胞外陷阱NETs。NETs是一种复杂的三维网状DNA结构，其上附着有多种具有杀伤病原体功能的组分。尽管对NETs形成机制、关键环节的研究有了很多突破，但对于还有哪些理化生物因素能够诱导NETs，以及关键的机制、分子是否存在共性，仍没有一个确切的答案。老年人群的疾病发生率和死亡率均远高于年轻人群，以感染相关疾病的情况最为突出，这与免疫衰老密切相关，即衰老对免疫系统功能功能的影响。中性粒细胞作为固有免疫的重要组成部分，衰老使其趋化能力受损、对细菌的清除能力减弱、炎症因子表达和抗凋亡活性改变。但其对NETs形成的影响证据不足、机制不清。如若衰老影响了中性粒细胞NETs形成和NETosis过程，那么是否还会影响另一种死亡形式，凋亡？衰老导致中性粒细胞NETosis与凋亡的改变，其中的关键环节是什么？本研究将着力解决上述三个问题。　　第一部分 TLR2配体诱导ROS和自噬依赖的NETs形成　　目的:　　中性粒细胞作为固有免疫系统的组分之一，其NETosis的过程及产物NETs，在机体抵抗病原体感染的过程中发挥着重要的作用。已经明确多种物质均可诱导中性粒细胞产生NETs，对于机体感染/抗感染、炎症反应/抗炎反应过程中的其他分子，能否刺激中性粒细胞产生NETs仍不清楚。本部分研究假设一:Toll样受体2(TLR2)配体能够有效诱导NETs形成。假设二:TLR2配体诱导的NETs形成为活性氧产物ROS依赖的。假设三:自噬过程同样参与了TLR2配体诱导的NETs形成。　　方法:　　实验一:为明确TLR2配体能否诱导NETs形成，提取的野生型WT小鼠原代腹腔中性粒细胞，体外经肽聚糖PGN刺激6h后，confocal下观察NETs形成。同时选择具有代表性的其他TLR2配体:LM、LTA、Pam3CSK4、Pam2CSK4、zymosan，confocal观察验证体外诱导NETs形成的能力。进一步以6种TLR2配体刺激中性粒细胞2、3、6h，采用荧光定量法检测NETs形成的强弱。实验二:为明确TLR2和MyD88在上述配体诱导NETs形成中的作用，采用TLR2 knock-out(KO)小鼠和MyD88 KO小鼠的中性粒细胞，体外给予PGN刺激6h，经confocal观察NETs形成。进一步采用荧光定量法分析上述6种配体体外诱导的WT、TLR2 KO和MyD88 KO小鼠中性粒细胞NETs形成是否存在差异。实验三:为明确TLR2配体与TLR4配体在诱导NETs上是否存在协同效应，采用极小剂量的LPS或PGN体外刺激中性粒细胞6h后经confocal观察。为进一步验证，采用荧光定量法进行检测。实验四:为明确NADPH氧化酶依赖的ROS产生是否为TLR2诱导的NETs形成所必需，采用gp91 KO小鼠进行实验。首先用流式细胞术检测gp91 KO和WT小鼠中性粒细胞胞内ROS的基础和PGN刺激后水平。进而使用定量检测分析比较gp91 KO和WT小鼠中性粒细胞TLR2配体诱导的NETs形成。进一步经Confocal观察TLR2配体刺激的gp91 KO小鼠中性粒细胞。实验五:为明确自噬过程是否参与TLR2配体诱导的NETs形成，同时给予雷帕霉素和PGN6 h同单独给予PGN后经confocal观察NETs形成。　　结果:　　实验一:与对照相比，PGN能够诱导典型的NETs结构。同时，选择的另外5种TLR2配体也均能够刺激中性粒细胞形成NETs。相比于对照组，6种配体均可显著提高培养上清液的荧光强度，提示NETs的形成增加。实验二:经confocal观察，PGN不能显著诱导TLR2 KO和MyD88 KO小鼠中性粒细胞的NETs形成。定量分析TLR2 KO和MyD88 KO小鼠中性粒细胞的NETs形成均低于WT型小鼠。实验三:极小剂量LPS和PGN均不能显著诱导NETs形成，而两者联合应用则可以明显增加NETs形成。定量分析得到类似的结果。实验四:gp91KO小鼠中性粒细胞胞内ROS的基础与WT小鼠无差异，在PGN刺激后则低于WT小鼠。多种TLR2配体刺激诱导的NETs形成均低于WT小鼠中性粒细胞。Confocal观察处理6h后也均未见显著的NETs形成。实验五:confocal观察并计数结果表明PGN加入雷帕霉素相比于单独使用PGN，进一步提高了NETs的生成。　　结论:　　多种TLR2配体可以有效诱导NETs形成;TLR2-MyD88通路为该过程所必需;TLR2配体和TLR4配体在诱导NETs形成上具有协同效应;NADPH氧化酶产生的ROS为TLR2配体诱导的NETs形成所必需;且自噬也参与该过程。　　第二部分老年小鼠中性粒细胞NETs形成障碍及其机制　　目的:　　免疫衰老，即衰老引起的免疫系统功能减退，影响着固有免疫和适应性免疫应答的方方面面。中性粒细胞功能的改变直接影响着老年个体对病原体的防御能力。衰老使得中性粒细胞趋化能力受损、对病原体的吞噬及清除能力降低、ROS的产生受到影响、抗凋亡能力发生改变、信号转导异常等。但对于老年个体NETs形成的影响证据较少，机制不清。本部分研究假设一:老年小鼠中性粒细胞NETs形成存在障碍，弱于年轻小鼠。假设二:老年和年轻小鼠中性粒细胞自噬活性的差异是NETs形成障碍的原因。假设三:ATG5是老年小鼠中性粒细胞TLR信号诱导的自噬活性缺陷的关键分子。假设四:老年小鼠中性粒细胞NETs形成障碍还存在其他机制，如趋化能力减弱，ROS产生减少。　　方法:　　实验一:为明确老年和年轻小鼠中性粒细胞体内NETs形成能力是否存在差异，取年轻和老年小鼠构建盲肠结扎穿刺CLP模型，获取6h后腹腔灌洗液，采用confocal观察其中NETs形成的情况。进一步采用荧光定量法分析两种小鼠CLP后腹腔灌洗液中的NETs含量。实验二:为明确老年和年轻小鼠趋化能力差异对NETs形成的影响，采用流式细胞术检测CLP模型6h后腹腔募集的中性粒细胞比例。为排除衰老后骨髓中性粒细胞生成能力对募集到腹腔的中性粒细胞比例的影响，采用流式细胞术检测老年和年轻小鼠骨髓中性粒细胞的比例。实验三:提取老年小鼠腹腔中性粒细胞，在体外用第一部分研究所述6种TLR2配体刺激6h后经confocal观察。进一步采用荧光定量法对比年轻和老年小鼠NETs形成能力的差异。为明确除TLR2配体外其他刺激下老年小鼠中性粒细胞NETs形成是否也存在障碍，体外给予LPS刺激6h后经confocal观察并一步用定量分析证实。实验四:为明确中性粒细胞表面TLR2数量是否影响老年小鼠NETs形成，采用流式细胞术检测PGN刺激前后老年和年轻小鼠中性粒细胞膜表面TLR2数量。进一步检测TLR2配体诱导的ROS产生是否有差异。实验五:为明确年轻和老年小鼠中性粒细胞在TLR2配体刺激后自噬活性是否存在差异，采用Western blot检测基础水平和PGN刺激2、4、6h后中性粒细胞中LC3B的蛋白表达。为进一步证实低自噬活性参与了老年小鼠中性粒细胞NETs形成障碍，体外PGN刺激的同时，给予雷帕霉素以提高自噬活性，验证其能否改善老年组NETs形成。实验六:分析公开发表的高通量转录组基因数据，寻找老年组和年轻组间自噬相关的差异表达基因。进一步采用western blot验证差异基因的蛋白表达水平。　　结果:　　实验一:老年小鼠CLP6 h后腹腔灌洗液中NETs形成明显少于年轻小鼠。定量分析的结果类似。实验二:老年小鼠CLP6 h后腹腔灌洗液中CD11b+Ly6G+细胞群比例低于年轻小鼠。而老年和年轻小鼠骨髓中性粒细胞群的比例无差异。实验三:老年中性粒细胞在TLR2配体刺激下均不能有效形成NETs，荧光定量分析表明老年组NETs形成明显低于年轻组。相比于年轻小鼠，LPS刺激的老年组NETs形成也存在障碍，定量分析得到类似结果。实验四:老年和年轻小鼠中性粒细胞膜表面TLR2数量在静息状态下和PGN刺激后无明显差异。而6种TLR2配体体外刺激老年小鼠中性粒细胞3h诱导的胞内ROS产量均低于年轻小鼠。实验五:年轻和老年小鼠的LC3B表达在PGN刺激后逐渐升高，在所有时间点，老年组的蛋白表达水平均低于年轻组。体外同时给予PGN和雷帕霉素，老年小鼠中性粒细胞的NETs形成能力得到了一定程度的恢复。实验六:高通量数据分析发现ULK1、ATG13和ATG5的转录表达存在差异。Western blot结果表明各个时间点老年组ATG5的蛋白表达水平均低于相应的年轻组，而ULK1、ATG13的表达差异不明显，此外，老年组mTOR的表达水平略高于年轻组。　　结论:　　在体和体外多种TLR配体的刺激下，老年小鼠中性粒细胞NETs形成弱于年轻小鼠。刺激后自噬活性低可能是原因之一。ATG5是老年小鼠中性粒细胞TLR信号诱导自噬活性缺陷的关键分子。还可能存在别的影响老年小鼠NETs形成的因素，包括趋化能力、ROS产量和mTOR活性。　　第三部分老年小鼠中性粒细胞自噬缺陷致凋亡活性改变　　目的:　　正常情况下，静息状况的中性粒细胞会发生自发性凋亡;而活化的中性粒细胞除凋亡外还可以走向NETosis。老年小鼠中性粒细胞的NETs形成能力减弱，那么细胞凋亡水平在老年个体上是否也发生改变？是否受同一细胞过程的调控？本部分研究假设一:在TLR2配体刺激下，老年小鼠中性粒细胞更倾向于凋亡。假设二:老年和年轻小鼠在凋亡和NETosis水平上的差异均受自噬活性的调控。　　方法:　　实验一:为明确老年和年轻小鼠在TLR2配体刺激下凋亡活性是否存在差异，将老年和年轻小鼠的腹腔中性粒细胞体外给予PGN刺激6、12h，采用流式细胞术分析细胞凋亡比例。实验二:为明确TLR2信号诱导的中性粒细胞凋亡是否受自噬调控，年轻小鼠中性粒细胞体外PGN刺激的同时，给予自噬抑制剂wortmannin或balfilomycin A1，观察凋亡比例的变化。在老年细胞上重复该实验。进一步在年轻和老年小鼠中性粒上给予PGN和自噬增强剂，观察凋亡变化。实验三:在年轻小鼠细胞上应用PGN和自噬抑制剂，经confocal同时观察凋亡和NETosis水平，检验自噬同时调控凋亡和NETosis的假说。　　结果:　　实验一:静息6h和PGN刺激6/12 h后，老年组的中性粒细胞凋亡比例均高于年轻组。实验二:同时给予PGN和wortmannin或balfilomycin A1相比于单纯给予PGN进一步提高了凋亡细胞的比例，老年细胞的结果类似。而自噬增强剂能够减少凋亡比例。实验三:给予PGN和两种自噬抑制剂后，细胞NETosis减少，凋亡明显增加。　　结论:　　老年小鼠中性粒细胞在TLR2配体刺激下更倾向于凋亡，而非NETosis。中性粒细胞的自噬过程同时调控了NETosis和凋亡，老年组低自噬活性导致其NETs形成障碍，更易发生凋亡。