研究背景放疗是恶性肿瘤临床治疗的常用手段之一,其特点是疗效确切,创伤小、毒副作用较低而广泛地运用于临床。但是,由于射线不具备甄别能力,其在杀伤肿瘤细胞的同时,也会对正常组织细胞产生影响,因而也会出现不同程度的副反应,这些副反应在临床上被称之为放射性损伤(Radiation Induced Injury RII),对于接受过胸部放疗的患者,这一副反应被称之为放射性肺损伤(Radiation Induc ed Lung Injury RILI),临床上根据病程时间长短[1]分为放射性肺炎(Radiation-induced Pneumonitis RP)和放射性肺纤维化(Radiation pulmonary fibrosis RP F)。RP不仅限制了患者所接受的照射剂量有所限制,导致肿瘤局部的控制率下降,还会出现无法耐受的不良反应而迫使治疗中断,影响后期治疗及康复,更严重的会引发相关性的死亡。目前,西医对待这类疾病只能采取经验治疗(即对症治疗)配合以激素疗法,改善患者症状,只能起到治标的作用,无法从根本上解决这一问题。关于RP的发生机制较为公认的是“细胞因子级联学说”,该学说[2]认为肺实质细胞经射线照射后产生了氧化损伤,导致各类炎性因子、趋化因子在局部聚集,诱发炎症反应,进一步引起体内白细胞、中性粒细胞的聚集,形成一系列类似“瀑布”的连锁反应,最终导致RP发生。自噬[3]作为进化上的一种高度保守的分解代谢途径,是细胞在极端条件下保持细胞稳定,维持细胞活性的重要机制。其特点会形成一个双层膜结构的吞噬泡,包绕受损的蛋白或细胞器,形成一个单独的封闭空间,随后与溶酶体结合对包裹物质进行降解和重新利用,维持细胞稳态。研究资料显示[1],射线产生的氧化应激损伤能够在一定程度上抑制机体的自噬,从而加重损伤反应,Chaachouay H[5]的研究则进一步证实,上调自噬活性能够在一定程度上抵抗辐射带来的损伤。祖国传统医学将RP归属于“肺瘘”“肺痹”的范畴,认为其属本虚标实之象,RP的发生与肺津不足、外感热毒、痰瘀内阻存在着很大的相关性,中国中医科学院广安门医院肿瘤科侯炜教授基于此理论,运用益气养阴、清肺解毒之法治疗放射性肺炎取得了不错的临床疗效。中药养阴清肺活血方由麦冬、天冬、黄精、生地、川贝粉、杏仁、鱼腥草、西洋参、三七粉、甘草组成,全方共益气养阴,活血解毒之功,前期临床研究[6]显示,养阴清肺活血方能够有效地改善患者气短、乏力等临床症状,降低Watters评分,前期基础实验[7]也显示,养阴清肺活血方能够明显改善放射性肺炎大鼠肺脏出血水肿状态,同时还能降低局部TNF-a、TGF-β以及IL-6的表达,从而减轻肺脏炎症反应。为进一步探究养阴清肺活血方治疗放射性肺炎的具体作用机制,我们提出养阴清肺活血方可能是通过干预肺泡巨噬细胞自噬进而改善放射性肺炎,并对此进行实验验证。研究目的1、通过回顾性临床研究,验证养阴清肺活血方治疗放射性肺炎的临床疗效。2、建立大鼠肺泡巨噬细胞放射性肺炎细胞模型,观察养阴清肺活血方对其白噬活性的调节作用,从分子水平揭示养阴清肺活血方治疗放射性肺炎的作用机理,阐释养阴清肺活血方治疗放射性肺炎的科学作用机制,为养阴清肺活血方在临床中的运用奠定科学的理论基础和事实依据。研究方法1、临床研究收集2010年1月-2017年12月就诊于中国中医科学院广安门医院门诊与病房的放射性肺炎病例按照其所接受的治疗方式分为治疗组和对照组各40例,其中治疗组的患者接受过养阴清肺活血方+激素(醋酸泼尼松片)治疗,对照组的患者则仅接受过激素(醋酸泼尼松片)治疗,通过回顾性研究验证养阴清肺活血方的临床疗效。2、基础研究Ⅰ 采用大鼠肺泡巨噬细胞NR-8383经X线加速器构建放射性肺炎细胞模型,并对其进行验证。Ⅱ 通过MTT法检测中药养阴清肺活血方对大鼠肺泡巨噬细胞增殖能力的影响,并通过对DNA氧化损伤指标8-OHdG、脂质氧化损伤指标MDA的检测来判定其对于细胞氧化损伤的影响。Ⅲ 通过电镜扫描,观察细胞中的自噬流情况。Ⅳ 通过Western-blot法检测LC3与P62蛋白的表达,观察养阴清肺活血方对大鼠肺泡巨噬细胞自噬活性的调节情况。Ⅴ 通过Western-blot法检测养阴清肺活血方对大鼠肺泡巨噬细胞中LKB1/AMPK/mTOR/ULK1 通路的影响。Ⅵ 通过Real-time PCR检测养阴清肺活血方对AMPK通路上游调控基因LKB1的影响。实验结果1、临床研究研究共纳入患者80例,治疗前两组患者在年龄、性别、病种、Watters评分、RTOG评级、KPS评分以及中医症状评分等方面均无统计学差异。经一疗程治疗后,在Watters评分方面:治疗组Watters评分为7.95±2.62,对照组Watters评分为9.5±2.69,两组经统计学比较,p=0.015<0.05,具有统计学差异;在RTOG评级方面:治疗组总有效率为75%,RTOG评级为1.5±0.82,对照组总有效率为60%,RTOG评级为1.65±0.83,经统计学比较。P=0.43>0.05,不具有统计学差异;在KPS评分方面:治疗组KPS平均分83.5 ± 6.22,对照组KPS平均分79.5±8.75,经统计学比较,p=0.02<0.05,具有统计学差异;在中医症状方面:咳嗽症状评分治疗组为1.1±0.81,对照组为1.05±0.78,经统计学比较,p=0.77>0.05,不具有统计学差异;气短症状评分治疗组为1.13±0.88,对照组为1.65±0.95,经统计学比较,p=0.01<0.05,具有统计学差异;乏力症状评分,治疗组为0.83±0.84,对照组为1.55± 1.10,经统计学比较,p=0.001<0.05,具有统计学差异。2、基础研究Ⅰ 采用6Gy X线加速器照射大鼠肺泡巨噬细胞可以模拟构建放射性肺炎细胞模型。Ⅱ 与模型组相比,养阴清肺活血方可以明显提高照射后大鼠肺泡巨噬细胞的增殖能力,差异具有统计学意义。Ⅲ 养阴清肺活血方能明显降低照射后大鼠巨噬细胞中氧化损伤指标8-OHdG和MDA的表达,差异具有统计学意义。Ⅳ 通过电镜扫描,在中药养阴清肺活血方组细胞中发现了自噬小体的存在,证实了养阴清肺活血方可以激活自噬。Ⅴ 与模型组相比,中药养阴清肺活血方组大鼠巨噬细胞中P62表达降低,LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值升高,差异具有统计学意义。Ⅵ 与模型组相比,中药养阴清肺活血方组细胞中LKB1、AMPK、ULK1表达升高,m-TOR表达降低,差异具有统计学意义。Ⅶ 与模型组相比,中药养阴清肺活血法组细胞中LKB1基因表达明显升高,且差异具有统计学意义。结论1、激素治疗加载养阴清肺活血方治疗放射性肺炎在降低患者RTOG等级,改善其咳嗽的临床症状的方面与单用激素的疗效基本相当,在改善乏力、气短等临床症状,降低Watters评分以及提高生活质量方面明显优于单用激素,且未见明显不良反应,临床安全性好;2、6Gy X线照射大鼠肺泡巨噬细胞后可以模拟构建放射性肺炎体外细胞模型;3、放射性肺炎过程中肺实质细胞出现了氧化损伤;4、养阴清肺活血方可以通过直接激活LKB1和UKL1,抑制mTOR的双通路途径激活AMPK诱导细胞自噬;5、养阴清肺活血方可能通过激活AMPK通路诱导自噬减轻氧化应激损伤从而改善放射性肺炎。