研究背景:环境中抗生素耐药性细菌(简称耐药菌)的污染及抗生素耐药基因的扩散已成为全球危机。据世界卫生组织报道,耐药菌正蔓延至世界各地,到2050年,抗生素耐药每年将导致100万人早死。抗生素耐药基因的扩散情况日趋严峻,以至于其已被列为一项新型环境污染物,成为当今国际研究的重点和热点。抗生素耐药基因的水平转移是导致耐药基因扩散的重要原因。耐药基因大多编码在质粒上,通过质粒介导的接合转移将耐药基因在微生物间进行传播和扩散是基因转移最常见,也是最有效的方式。地表水是耐药菌和耐药基因的巨大储存库。它不仅汇聚和容纳了来自降水径流,医院污水、生活污水、养殖污水和实验室污水等各种来源的的耐药菌、耐药基因甚至多重耐药基因外,还承载着一部分内源性的污染,比如耐药基因在水环境中的随机耐药突变和自然转移。水生动物是生存在水环境中的重要生物,其摄食的环境中充满了耐药菌和耐药基因。水生动物肠道是细菌生长和繁殖的重要场所,同时,肠道中定植的大量固有菌群都可以作为潜在的受体菌。因此,耐药基因在水生动物体内的转移和扩散也可能是地表水耐药基因内源性污染的一部分。但是,耐药基因是否能在水生动物体内发生扩增,目前尚未见报道。基因发生抗性突变和自然转移的效率只有百万分之一。并且研究发现,即使在水中存在的各种物理、化学和生物因素尤其是丰富的DNA酶类的作用下,也无法使耐药基因变性和分解。水中耐药菌和耐药基因的污染依然严重。除此之外,还有研究报道了在水产养殖的水体及鱼的粪便和肠道中检出耐药菌和耐药质粒。基于以上全部事实,我们认为水环境中的耐药基因除了接纳各种水体中的耐药基因和在水环境中发生耐药突变和随机转移的少量耐药基因外,更主要的是其在水生动物体内转移与扩增的结果。综上所述,课题提出“水生动物肠道是地表水中耐药基因转移和扩增的重要场所”假说。研究目的和意义:本研究旨在通过建立耐药基因在水生动物体内定植和转移的模型,在采用细菌培养和分子生物学等技术方法的基础上,定性、定量地研究耐药菌及耐药基因在水体动物体内定植和转移的规律,阐明耐药基因在水生动物肠道内的转移和扩增机制,摸清耐药基因发生定植和转移的消化道部位与转移发生机理,以及明确肠道内接受耐药基因的接合子的种类和数量。课题研究成果为进一步丰富人们对耐药基因在动物体内转移和扩增的规律和机制的认知及提供了充分的理论依据,同时也为水产养殖用药,水源水保护以及生态环境的污染和管理提供了数据依据和技术支撑。研究内容和研究方法:(1)采用RED重组技术构建供体菌K12Cm: RP4,并通过将供体菌饲喂给斑马鱼构建RP4质粒介导的耐药基因在斑马鱼肠道内接合转移模型。(2)采用选择性平板筛选和qPCR技术研究斑马鱼粪便中耐药菌和耐药基因的体外排出量随时间的变化规律。(3)利用选择性平板筛选和qPCR技术研究耐药菌和耐药基因在斑马鱼肠道内的时空分布规律。(4)采用双荧光标记供体菌,流式细胞分选并联合16S rDNA高通量测序的方法肠道鉴定肠道和粪便中受体菌的细菌物种和丰度组成。(5)利用qPCR法检测RP4质粒接合转移调控基因在斑马鱼肠道中的mRNA表达。研究结果:(1)斑马鱼肠道和粪便的固有菌群都不含有RP4质粒,除了对氨苄青霉素耐药外,对四环素,卡那霉素和氯霉素均敏感。因此课题利用RED重组技术,在野生株大肠杆菌K12的基础上构建了基因组被氯霉素抗性基因cat标记,并携带RP4质粒的供体菌K12Cm: RP4。通过每日定时定量向饲料中掺入供体菌,持续喂食斑马鱼,建立耐药质粒在斑马鱼肠道内的接合转移模型。(2)斑马鱼摄入的外源性耐药菌,大部分排出体外并沉积在粪便。12%的粪便固有细菌通过RP4质粒的接合作用获得了耐药基因。喂食斑马鱼供体菌90天后停止,粪便中耐药菌和耐药基因排出的规律曲线可以分为三个阶段:上升期,平台期和下降期。在摄入108cfu/(d·fish)供体菌的高剂量组,cat基因和traG基因在平台期的粪便排出相对数量分别为2.37%和15%,而摄入107cfu/(d·fish)供体菌的中剂量组,cat基因和traG基因在平台期的粪便排出相对数量都不到1%。与高剂量组相比,中剂量组的供体菌和接合子达到平台期所用的时间更短,产生的接合子数少大约一个数量级。在摄入106cfu/(d·fish)供体菌的低剂量组中没有观察到明显的供体菌和耐药基因的排出规律,也没有检测到接合子。接合子的产生数量和到达平台期的时间与供体菌的喂食浓度相关。(3)外源性耐药菌和耐药基因在整个消化道内的分布是极不均匀的。前肠和中肠中耐药菌和耐药基因存在的数量较少,并且它们的分布没有显著性差异。后肠是外源性耐药菌和接合子定植,以及耐药基因分布的最主要的消化道场所,其中接合子的数量是其它肠段中的将近25倍。在喂食供体菌的过程中,耐药菌可以在肠道内定植,同时耐药基因在肠道内发生了大量的转移和扩散。但是外源性供体菌K12Cm:RP4在肠道内的定植具有暂时性,一旦斑马鱼不再摄入供体菌,肠道内的耐药菌和接合子数量会迅速下降,这可能是与肠道内缺乏抗生素选择压力有关。(4)肠道和粪便的接合子中既包括可培养细菌,也包括非可培养细菌,后者占全部接合子的90.4%～97.2%。其中气单胞菌属(Aeromonas)丰度最高,占全部细菌的90%以上(均值为90.0%～96.7%),是肠道固有菌群中接合转移发生频率最高,最容易获得RK2质粒的物种。其它的接合子主要来自Proteobacteria,Firmicutes和Fusobacteria菌门(加起来占大约5%)。除Aerowonas外,来自Proteobacteria门的可培养细菌Shewanella以及Enterobacteriaceae也是肠道固有菌群中重要的接合子。(5)耐药质粒在斑马鱼肠道内转移和大量扩增与调控基因在后肠的mRNA表达有关。在平台期,后肠中trbBp基因的mRNA表达量上调到7.16× 10-3 copies/cell,是上升期mRNA表达量的24倍。TrbBp基因的明显上调促使了细胞间的交配配对,从而形成接合的通道,促进了接合转移的第一步过程。同时,平台期trfAp基因的mRNA表达也在后肠出现了明显的上调,均值达到2.42×10-2 copies/cell,促使了RP4质粒携带耐药基因的跨膜转运,以及质粒DNA的复制、转移和分配,从而促进了接合转移的第二个过程。然而在前肠和中肠,平台期trbBp和trfAp基因的mRNA表达则上调的不够显著。因此,后肠是耐药质粒接合转移频率最高并且最活跃的消化道肠段。研究结论:1、建立了稳定的RP4质粒介导的耐药基因在斑马鱼肠道内转移和扩散的水生动物模型。2、斑马鱼摄入的外源性耐药菌,大部分会排出体外并沉积在粪便。12%的粪便固有细菌通过接合转移携带了 RP4质粒。喂食斑马鱼供体菌一段时间后停止,粪便中耐药菌和耐药基因排出的规律曲线可以分为上升,平台和下降三段。3、后肠是耐药菌和接合子定植,以及耐药基因分布的最主要的消化道场所。4、斑马鱼肠道受体菌中非可培养细菌占90.4%～97.2%,其中最重要的接合子是Aeromonas,占90%以上。可培养细菌只占不到10%,主要包括Enterobacteriaceae和Shewanella。5、耐药质粒在斑马鱼肠道内转移和大量扩增与调控基因在后肠的mRNA表达有关。后肠是耐药质粒接合转移频率最高,最活跃的肠段。