炎症(inflammation)是感染、非感染等多种损伤性刺激作用于机体,活化固有免疫系统的一种防御性反应,局部表现为红、肿、热、痛和功能障碍[1-3]。炎症是一把双刃剑,适度的炎症反应对机体是一种有效的防御措施,能起到杀灭病原微生物,限制病原体扩散的作用;但过度的炎症反应则会导致细胞因子等大量炎症介质释放入血,造成炎症失控,从而带来全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS),甚至多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS),危及患者生命[2-5]。脓毒症(sepsis)是指由感染引起的SIRS,临床上证实有细菌存在或有高度可疑感染灶,按其严重程度可分为:脓毒症、严重脓毒症(severe sepsis)和脓毒性休克(septic shock) [1-3]。脓毒症发生率高,病死率高,已经成为重症监护病房(ICU)内非心脏病人死亡的主要原因,严重影响人类的生活质量[1-3]。代偿性抗炎反应综合征(compensatory anti-inflammatory response syndrome,CARS)是1997年由Roger Bone提出的抗炎失控理论[6-7]。SIRS发病过程中,随着炎症介质的大量释放,体内产生内源性抗炎介质,如白细胞介素4( interleukin 4, IL-4) [8]、白细胞介素10 (interleukin 10, IL-10) [9]等来抑制和下调炎症介质的产生,以恢复促炎与抗炎的平衡,达到控制炎症和维持机体的自稳态。但由于过度的抗炎反应,导致抗炎介质过量释放和泛滥入血,机体出现CARS。CARS以免疫抑制为主,对机体可有利或有害。早期在一定程度上减轻了炎症对机体的损害,但到晚期常常因免疫功能的严重抑制而造成无法控制的感染[6-11]。数十年来,研究者陆续对SIRS和CARS中一些重要的促炎、抗炎介质展开了深入研究,但目前的研究成果只是揭开了复杂的调控网络的一角。病原体相关分子模式(pathogen associated molecular pattern, PAMP),如脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)、肽聚糖(peptidoglycan)、脂蛋白(lipoprotein)等侵入机体,通过识别并结合细胞膜表面模式识别受体(pattern recognition receptor, PRR),迅速启动机体固有免疫(innate immunity),建立抵御病原微生物的第一道防线[12-14]。机体主要的固有免疫细胞包括:吞噬细胞(phagocyte)、树突状细胞(dendritic cell)、自然杀伤细胞(natural killer cell,NK cell)等,而吞噬细胞,如单核细胞、巨噬细胞和多形核中性粒细胞,作为机体最主要的固有免疫细胞,在吞噬并杀灭病原微生物过程中发挥着重要的作用[14-15]。适应性免疫(adaptive immunity)应答则是机体针对特定病原微生物(抗原)产生的特异性高效防御机制,淋巴细胞,包括T淋巴细胞(Tlympbocyte)和B淋巴细胞(B lymphocyte)是介导适应性免疫的主要效应细胞[16]。单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞捕获抗原后,将抗原信息提呈给T淋巴细胞,从而在机体固有免疫和适应性免疫应答转换过程中建立起一座桥梁[17-18]。二者既有明确的阶段和步骤,又是相互间密切联系、有机统一的。固有免疫对适应性免疫的调控作用及其机制,一直是病理学和免疫学领域的研究热点[19-20]。髓样相关蛋白8 (myeloid-related protein-8,MRP8)和髓样相关蛋白14(myeloid-relatedprotein-14,MRP14)是新近鉴定的重要的内源性损伤相关模式分子(damage associated molecular pattern,DAMP) [21-22,27]。MRP8/MRP14 生物学功能极其丰富,可参与蛋白质磷酸化、细胞骨架重塑、细胞迁移、调节钙离子稳态、促进凋亡、花生四烯酸(arachidonic acid)代谢、对中性粒细胞中的NADPH氧化酶的调控等[22-25],但其在炎症及其相关疾病中的作用最近才受到重视。2007年,Johannes Roth实验室在鉴定调节脓毒症炎症级联反应(inflammatory cascade)的新成份时发现,MRP8/MRP14在脓毒症发生发展过程中具有重要的功能,MRP8-MRP14寡聚体缺陷的小鼠能够抵抗内毒素引起的致死性休克以及大肠杆菌导致的腹部脓毒血症。当巨噬细胞受到刺激活化后,MRP8和MRP14蛋白被合成并分泌到细胞外。MRP8/MRP14蛋白寡聚体能够放大这种由内毒素引发的炎症效应[26]。MRP8/MRP14属于钙离子结合蛋白S100家族成员,正常情况下,组成型表达于中性粒细胞与单核细胞,在中性粒细胞中含量丰富,约占可溶性胞浆成分的50%;巨噬细胞受到炎症刺激也可合成,然后在炎症因子的刺激下释放到细胞外,引起血中浓度升高[27]。病理状态下,胞内MRP8/MRP14通过坏死或活化细胞主动或被动释放到细胞外,作为重要的DAMP分子发挥免疫调节作用[22,26-27]。与此同时,MRP8与MRP14蛋白在多种炎症性自身免疫相关疾病中的意义也相继报道,如MRP8与MRP14在风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、巨细胞动脉炎、多发性硬化症、囊肿性纤维化、自身免疫性疾病以及慢性肠炎等病人血清中的水平显著升高,而且这两种蛋白阳性的髓样细胞(myeloid cell)是炎症损伤时最先发生浸润的细胞,提示它们在炎症与自身免疫性疾病的发展过程中可能有着很重要的功能[28]。体外研究表明,LPS与促炎细胞因子,如肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factor-α,TNF-α)、IL-1,可诱导人髓样细胞MRP8与MRP14的表达上调[26,29-31]。MRP8/MRP14在局部表现出细胞因子样的作用,最显著的功能就是可以将白细胞吸引到炎症部位。体外研究提示MRP8/MRP14可促进粘附分子,如VCAM-1(vascular cell adhesion molecule-1)与 ICAM-1 (intercellular adhesion molecule 1)等的表达,通过增强ICAM-1与CD11b/CD18 (Mac-1)结合来调控髓样细胞跨内皮迁移,从而促进炎症相关细胞的募集(recruitment) [32]。MRP8/MRP14同时又可促进促炎细胞因子(proinflammatory cytokine)表达与释放,而释放到细胞外的促炎细胞因子可进一步促进MRP8/MRP14的表达与释放,以正反馈调控的方式对炎症信号进行放大[26,34]。尽管目前对于MRP8/MRP14参与炎症反应的机制有了一些认识,但仍有很多问题尚不清楚,特别是分泌到细胞外的MRP8/MRP14如何作用于细胞并产生效应。目前已知细胞外MRP8/MRP14寡聚体的功能依赖于与靶细胞表面特异性受体的结合。研究显示,晚期糖基化终末产物受体(receptor of advanced glycation end-product,RAGE)[33]、CD36[34]、Toll样受体 4 (Toll-like receptor 4, TLR4) [26]可能是 MRP8/MRP14 细胞膜受体。然而它们并不是MRP8/MRP14向细胞内传递信号的唯一方式,细胞膜表面可能还存在其他受体或其他可能的信号转导方式。由此可见,MRP8/MRP14作用于细胞的信号转导过程非常复杂,可能在不同来源的细胞中,MRP蛋白中的不同结构域与细胞表面的不同受体发生作用,从而介导不同的生物学效应。TLR4是Toll样受体TLR家族成员之一,是一种重要的模式识别受体[13,18],主要表达于细胞膜,感受外源PAMP和受损或死亡细胞释放的DAMP分子的刺激,通过募集下游的接头蛋白,导致细胞内信号级联反应,从而介导机体固有免疫和适应性免疫,在固有免疫和适应性免疫间的转换中发挥重要的作用[35-39]。TLR4是研究最多和最热点的一类PRR,主要的配体是细菌、病毒或自身产生的LPS,此外多种重要的DAMP分子如高迁移率族蛋白1 (high mobility group box protein 1, HMGB1)、MRP8/MRP14也能够刺激其活化[13]。TLR4主要表达于各种免疫细胞,包括巨噬细胞、DC、B细胞及特定类型的T细胞,同时还大量表达于各种上皮和内皮细胞等固有免疫的第一道防线[35]。同时,研究表明TLR可以通过DC及其分泌的细胞因子来调节适应性免疫,DC细胞捕获病原微生物抗原,捕获抗原的DC进一步迁移至次级淋巴组织将抗原呈递给初始T细胞,从而介导T细胞的激活。有研究者指出DC吞噬抗原后是否能够有效的将抗原肽递呈给T细胞和B细胞,取决于抗原中是否存在TLR有效的配体,DC有选择地递呈病原微生物抗原,而不递呈不含TLR配体的凋亡细胞抗原[40-42]。由此可见,TLR在炎症过程中介导适应性免疫反应发挥着不可忽视的作用,但目前的研究只是冰山一角,TLR桥连固有免疫和适应性免疫的机制,人们还并不完全清楚。干扰素诱导蛋白 10 (interferon-y inducible protein 10, IP-10)是 CXC 类趋化因子亚族重要成员之一[43]。主要由活化的单核巨噬细胞产生,并以自分泌或旁分泌的形式作用于单核巨噬细胞、T淋巴细胞等。在炎症反应过程中,血液流变学发生改变时,单核细胞、T淋巴细胞、NK细胞和血管内皮细胞接触后可诱导合成大量IP-10,后者可促进细胞表面的选择素和整合素表达,对细胞穿透血管定向迁移到炎症部位有重要意义[4445]。IP-10通过与其特异性受体CXCR3结合,主要趋化活化的T淋巴细胞、NK及NKT细胞,从而在适应性免疫应答中发挥重要的作用[45-46]。我们在前期筛选MRP8/14诱导单核巨噬细胞释放细胞因子的工作中发现IP-10明显升高。MRP8/14在中性粒细胞中含量丰富,释放到细胞外的MRP8/14可作用到单核巨噬细胞,诱导IP-10的产生,而IP-10进一步趋化活化的淋巴细胞到达炎症部位。因此,我们设想这种细胞-细胞间的cross-talk有可能是炎症过程中介导固有免疫和适应性免疫转换的重要机制。基于以上理论背景,我们针对MRP8/14诱导单核巨噬细胞表达IP-10的信号机制进行了深入研究,并进一步探讨了其介导的生物学意义。我们体外培养了人THP-1单核细胞及小鼠RAW264.7巨噬细胞,分离并培养肺、骨髓来源的巨噬细胞,利用Luminex及RT-PCR、Real-time PCR技术观察了 MRP8/14诱导人THP-1细胞IP-10表达的时间和浓度效应,MRP8/14诱导IP-10表达与IFN-γ的关系以及IP-10表达可能的调控机制,同时我们构建了MRP14不同结构域融合蛋白,筛选了 MRP蛋白发挥诱导效应的结构域;进一步我们利用基因敲除小鼠、激酶抑制剂、Western blot及EMSA方法筛选并验证了MRP8/14诱导IP-10表达的细胞膜受体及参与的信号通路;最后针对MRP8/14诱导IP-10表达的生物学意义进行了研究,我们体外活化淋巴细胞并使其高表达CXCR3,利用Boyden Chamber实验在体外验证了 MRP8/14-IP10对活化的淋巴细胞的趋化效应;同时在脓毒性休克小鼠模型中,利用Airpouch实验在体内进一步验证了 MRP8/14-IP10对活化的淋巴细胞的趋化效应。通过研究,我们证实了 :(1) MRP8/14能够以时间和浓度依赖性方式有效诱导THP-1细胞IP-10的表达;MRP8/14刺激THP-1细胞后6 h即可在培养上清中检测到IP-10蛋白的升高,随着刺激时间的延长,其表达呈递增趋势,差异有统计学意义(F=316.9000,P=0.000); IP-10mRNA则在刺激后1h即升高,持续增加,在6h达到高峰,12 h开始下降,24 h恢复至正常水平。0.75μg/ml MRP8/14蛋白即能显著诱导IP-10的表达,随着刺激浓度的增加,IP-10表达进一步显著增加,差异有统计学意义(F=55.560,P=0.000)。(2) MRP8/14以IFN-y非依赖型途径诱导THP-1细胞IP-10表达;MR]P8/14刺激并不能诱导IFN-γ的合成(F=1.205, P=0.364),且IFN-y中和性抗体对MRP8/14诱导IP-10的表达无影响(P>0.05)。(3) MRP8/14主要在转录水平调控IP-10的表达,MRP蛋白以包含有钙离子结合基序的结构域具有生物学活性;通过使用各转录合成抑制剂放线菌素D(ActD)和新蛋白合成抑制剂放线菌酮(Cyclo)的抑制效果不同(F=229.822,P=0.000),发现IP-10mRNA仅能被ActD抑制(P<0.01),Cyclo则对其没有影响(P>0.05),提示MRP8/14主要在转录水平参与IP-10的表达调控。同时构建的MRP14不同结构域融合蛋白活性有差异(F=251.061,P=0.000),以包含有钙离子结合基序的结构域EF hand-1、EF hand-2、EF hand-1+2具有诱导IP-10表达的生物学活性(P<0.01),而其羧基末端则缺乏诱导活性(P>0.05)。(4)MRP8/14通过活化TLR4受体诱导THP-1细胞IP-10的表达;MRP8/14刺激后,TLR4-/-组与正常组相比,IP-10蛋白及mRNA表达明显受抑制,而RAGE-/-组IP-10蛋白及mRNA表达则不受影响。(5) JNK、JAK1/3-STAT1 及 NF-κB 信号通路参与了 MRP8/14 诱导的 IP-10的表达(F=589.655, P=0.000; F=1183.000, P=0.000);激酶抑制剂结果显示JNK激酶抑制剂SP600125能够部分抑制IP-10的表达,JAK1、JAK3激酶抑制剂 JAK inhibitor I、JAK3 inhibitor 基本能够完全抑制 IP-10 的表达(P<0.01);NF-κB抑制剂PDTC、Bay11-7082能够部分抑制IP-10的表达,STAT1抑制剂MTA也能部分抑制IP-10的表达(P<0.05)。而进一步Western blot和EMSA也验证了 JNK、JAKI/3-STAT1激酶的磷酸化变化及NF-κB的DNA转录活性。(6)体外MRP8/14通过刺激单核巨噬细胞表达IP-10趋化活化的淋巴细胞,并可能被IP-10中和性抗体、激酶抑制剂、TLR-/-等因素阻断(F=225.748,P=0.000);体外PHA协同IL-2活化淋巴细胞,高表达CXCR3及CD69; MRP8/14刺激正常小鼠骨髓来源巨噬细胞上清能够显著趋化活化的淋巴细胞,IP-10中和性抗体能够抑制这一效应(P<0.01),JAK inhibitor I、JAK3 inhibitor基本能够完全抑制趋化效应(P<0.01),SP600125及Bay11-7082也能够部分抑制趋化效应(P<0.01)。MRP8/14刺激TLR-/-、鼠骨髓来源巨噬细胞上清则失去此趋化效应(P<0.01)。(7)脓毒性休克小鼠体内MRP8/14通过刺激单核巨噬细胞表达IP-10趋化活化的淋巴细胞(F=167.448, P=0.000);脓毒性休克小鼠模型中,LPS刺激8h即可观察到脾脏淋巴细胞的大量活化,CXCR3和CD69表达显著升高,16 h达到高峰,24 h有所下降。MRP8/14刺激单核巨噬细胞上清能够显著趋化活化的淋巴细胞(P<0.01)。本研究通过信号转导通路及生物学效应的研究,提出了 MRP8/14-TLR4-IP10表达的信号通路调控模型:炎症过程中,浸润至炎症部位的中性粒细胞坏死释放大量的炎症介质MRP8/14,而释放的MRP8/14可通过细胞膜表面TLR4受体,进一步作用于抗原递呈细胞-单核巨噬细胞,从而激活细胞内JAK1/3-STAT1、NF-κB及JNK信号通路,使其释放重要的趋化因子IP-10,于是在炎症部位的血管内外形成趋化因子的浓度梯度,而高表达CXCR3受体的淋巴细胞,包括T、B淋巴细胞,则在浓度梯度的趋化作用下,沿着血管进一步渗入至炎症部位,从而诱导机体适应性免疫反应。本研究对于我们深入认识脓毒症过程中固有免疫和适应性免疫的转换机制有深远的意义,相信可以为进一步的临床研究提供更好的思路和切入点。