多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid, PUFA)指含有两个或两个以上双键且碳链长为16-22个碳原子的直链脂肪酸,如EPA(eicosapentaenoic acid, 20:5)和DHA(docosapentaenoic acid, 22:6),他们对人类健康非常重要,比如:减轻炎症,调节血压,降低胆固醇的含量,调控脂类代谢,预防和治疗动脉粥样硬化和心血管疾病,调节机体的免疫功能,调节中枢神经系统功能,还可以开发为抗肿瘤药物。目前,EPA和DHA主要来源于深海鱼油,但是随着市场需求的迅速增长和海洋可捕捞鱼类资源的日益减少,深海鱼油已经远远不能满足需要,因此,寻找更为持续、稳定的LCPUFAs来源成为当务之急。海洋微藻是EPA和DHA的初级生产者,从微藻中提取PUFA的生产工艺比鱼油简单,而且产品没有鱼腥味,胆固醇含量低。但是海洋微藻多为自养藻,生长缓慢,细胞得率低,培养过程中容易染菌,所以,大规模从微藻中提取生产EPA和DHA来满足社会需求还不能实现。PUFAs生物合成始于LA和ALA,该生物合成过程中涉及到一系列脂肪酸去饱和酶(fatty acid desaturase, FAD)和脂肪酸延伸酶(fatty acid elongase, FAE)。FAD脱氢反应的机制是将脂肪酸链中C-C转化为C=C,每个FAD都在酰基链的特定位置引入双键。近年来,对海洋微藻PUFAs合成相关酶基因的研究进展非常快,已经从多个藻种中克隆了参与EPA和DHA合成所涉及的去饱和酶基因和延伸酶基因,并且实现了基因的异体表达,这为实现得到高产的PUFAs,解决EPA/DHA资源问题,降低生产成本,提供了一条新的途径。D5的功能验证具有重要的生化应用意义,该基因能够被用在富含PUFA的转基因油料作物上,具有重要的医疗和保健作用。加深对PUFA合成过程中基因调解机制的了解将会影响单细胞油脂的产量,比如,改善微藻的生长条件,可以将强EPA/DHA的产量,进而可以影响依靠微藻的养鱼业的发展。此外,FAD和FAE在食品工程,植物基因工程以及发酵工程等领域的广阔应用前景是毋庸置疑的,另外,二者在上述领域的应用将加深促进人们对脂肪酸合成途径的认识和研究。本论文实验材料三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)为自养藻,EPA含量丰富,可达总脂肪酸的30%以上,还含有少量的DHA,是研究脂肪酸合成途径中相关去饱和酶的非常好的实验材料。本文的工作内容和研究成果如下:1.以三角褐指藻为研究材料,实验室培养,通过对其培养基中氮营养盐限制胁迫不同时间(12h、24h、48h、72h、96h),研究了不同时间的氮营养盐胁迫对三角褐指藻生长生理及其脂肪酸组成的影响。试验结果表明,在试验设置的氮营养胁迫时间范围内,与对照相比,三角褐指藻的生长没有明显的变化;随着氮胁迫时间的延长,叶绿素a,类胡萝卜素以及叶绿素的含量明显下降;EPA的含量占总脂肪酸质量分数比也随氮胁迫时间的延长而减小。2.Δ5脂肪酸去饱和酶(Δ5 fatty acid desaturase)是合成花生四烯酸(AA)和EPA的关键酶。为了构建三角褐指藻Δ5脂肪酸去饱和酶基因(简称D5)的原核表达重组质粒,并实现在E.coli BL21(DE3)中的表达。本研究根据GenBank中三角褐指藻D5序列,设计引物,扩增该基因并插入到pET28a中,测序鉴定后,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达产物。结果表明pET28a-D5构建成功,IPTG能诱导D5特异性表达。上述实验结果为真核生物膜蛋白的研究奠定基础。3.本实验将三角褐指藻D5分离并将其转入酵母中进行表达,结果显示,重组蛋白能够将DGLA和20:4Δ8, 11, 14, 17转化成AA和EPA,转化效率分别为24.7%和59.4%。该结果表明,Δ5脂肪酸去饱和酶在ω-6和ω-3脂肪酸合成途径中都具有活性,能同时发挥去饱和作用。所以,对该脂肪酸合成以及调节机制的了解,为将来研究去饱和酶基因在油料作物中的转基因提供了前提条件。总之,对D5在分子水平上的探讨为今后开展包括EPA合成在内的多项研究奠定了基础,为人类健康和营养提供了保证。