【摘 要】
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研究目的采用人脐带来源间充质干细胞源外泌体（human umbilical cord mesenchymal stem cells derived exosomes,hucMSC-EXO）作用巨噬细胞,研究hucMSC-EXO对巨噬细胞免疫调控和自噬功能的影响。实验方法1.联合超滤法和超速离心法分离纯化hucMSC-EXO并鉴定（1）利用Western blot技术检测外泌体CD9、CD81、Ts
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研究目的采用人脐带来源间充质干细胞源外泌体（human umbilical cord mesenchymal stem cells derived exosomes,hucMSC-EXO）作用巨噬细胞,研究hucMSC-EXO对巨噬细胞免疫调控和自噬功能的影响。实验方法1.联合超滤法和超速离心法分离纯化hucMSC-EXO并鉴定（1）利用Western blot技术检测外泌体CD9、CD81、Tsg101、Calnexin等蛋白的表达情况;（2）通过纳米颗粒追踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis,NTA）技术,检测外泌体的大小;（3）通过透视电镜（Transmission Electron Microscope,TEM）检测观察外泌体形态。2.PKH67标记hucMSC-EXO并与巨噬细胞共培养,分别在共培养时间点为1小时,2小时,3小时,4小时,8小时,24小时,48小时,72小时通过激光共聚焦显微镜观察巨噬细胞内PKH67标记hucMSC-EXO的荧光强度。3.hucMSC-EXO与LPS和IFN-γ联合刺激的巨噬细胞共培养24小时,RT-PCR方法检测巨噬细胞炎症因子TNF-α、IL-10、IL-1β的m RNA表达水平;ELISA检测细胞上清IL-1β、IL-10、IL-6的蛋白表达水平。4.将hucMSC-EXO和巨噬细胞共培养24小时后,Western blot检测巨噬细胞中p-AMPK、p-AKT、p-m TOR、p-ULK1、Beclin 1、ATG 7、LC 3等自噬通路及相关蛋白的表达。实验结果1.Western blot分析结果显示,分离纯化的hucMSC-EXO表达CD9、CD81和TSG101蛋白,不表达Calnexin蛋白;NTA结果显示外泌体粒径大小集中于131.9 nm;通过TEM镜下观察,外泌体形态为杯状结构。Western blot、NTA、TEM结果均符合外泌体的生物特征。2.通过激光共聚焦显微镜观察,巨噬细胞内PKH67标记外泌体的荧光强度在1小时,2小时,3小时,4小时,8小时,24小时中逐步增强,在24小时达到峰值,48小时和72小时荧光强度减弱。3.hucMSC-EXO与LPS和IFN-γ联合刺激的巨噬细胞共培养24小时后,荧光定量PCR结果显示hucMSC-EXO可下调LPS和IFN-γ刺激的巨噬细胞TNF-α转录水平;ELISA结果显示hucMSC-EXO可上调LPS和IFN-γ刺激的巨噬细胞IL-10的表达,下调IL-1β,IL-6的生成。4.Western blot结果显示,hucMSC-EXO处理的巨噬细胞,胞内p-AMPK、p-AKT、p-m TOR、Beclin 1、ATG 7、LC 3-Ⅱ蛋白表达均明显高于阴性对照组,而蛋白p62和p-ULK1则明显低于对照组。研究结论1.hucMSC-EXO可调节巨噬细胞免疫功能,促进抗炎因子的释放,抑制炎症因子的生成;2.hucMSC-EXO可激活AMPK和AKT信号通路,进而增强巨噬细胞自噬水平。
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