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目的:多壁碳纳米管(multi-walled carbon nanotubes,MWCNTs)具有优越的电学、力学、热学和光学性能,使其成为各种工业和消费产品的首选材料,被广泛应用于电子工程、计算机科学、生物医学和航空航天工业等领域。尽管目前缺乏流行病学证据,但已有动物实验结果证实MWCNTs经呼吸道途径暴露可在大鼠和小鼠体内诱导肺纤维化。因此MWCNTs暴露也给人体带来肺纤维化疾病的潜在风险。Sirtuin 6(SIRT6)是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamideadenine dinucleotide,NAD~+)依赖性组蛋白去乙酰化酶,属于sirtuin家族成员。以往研究表明SIRT6可抑制肝脏、肾脏和心肌组织中纤维化的发生。然而,SIRT6在MWCNTs诱导的肺纤维化中的作用尚无报道。已知上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是促进肺纤维化发展的关键过程之一。本研究以人支气管上皮细胞BEAS-2B为对象,研究SIRT6在MWCNTs诱导的BEAS-2B细胞EMT中的作用及其对MWCNTs激活的TGF-β/Smads信号通路的影响,为寻找MWCNTs致肺纤维化有效的治疗靶点提供科学依据。方法:通过透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)和扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)观测MWCNTs的微观结构和形貌;利用比表面积分析仪(Brunauer-Emmett-Teller,BET)测量MWCNTs的比表面积;通过热重分析(thermogravimetric analysis,TGA)测量MWCNTs的纯度;采用X射线衍射仪(X-ray diffraction,XRD)分析MWCNTs的物相组成。通过动态光散射法(dynamic light scattering,DLS)检测MWCNTs在培养基中的分散状态和稳定性。通过TEM观察MWCNTs是否能进入BEAS-2B细胞。通过CCK-8细胞活性检测试剂盒检测不同浓度(0.25μg/cm~2、1μg/cm~2、4μg/cm~2和16μg/cm~2)的MWCNTs处理BEAS-2B细胞72 h后的细胞活性,以确定MWCNTs染毒剂量。通过Western blot检测不同浓度(0.25μg/cm~2、1μg/cm~2和4μg/cm~2)的MWCNTs处理BEAS-2B细胞72 h后内源性SIRT6、上皮标志物E-cadherin、间质标志物vimentin和α-SMA蛋白表达水平。使用SIRT6的腺病毒过表达载体或SIRT6的shRNA腺病毒载体转染BEAS-2B细胞,过表达或敲低SIRT6,腺病毒转染24 h后用4μg/cm~2 MWCNTs处理BEAS-2B细胞72 h,采用Western blot检测E-cadherin、vimentin、α-SMA和SIRT6的蛋白表达水平。使用SIRT6的腺病毒过表达载体转染BEAS-2B细胞,使SIRT6过表达,腺病毒转染24 h后用4μg/cm~2 MWCNTs处理BEAS-2B细胞72 h,采用实时荧光定量PCR检测MMP-2、MMP-9、COL3A1和TGF-β1的mRNA表达水平;通过Western blot检测MMP-2和MMP-9的蛋白表达水平;通过Transwell迁移实验检测BEAS-2B细胞的迁移能力改变。使用腺病毒过表达野生型和无去乙酰化酶活性的突变体SIRT6(H133Y)后用4μg/cm~2MWCNTs处理BEAS-2B细胞1 h,通过Western blot检测SIRT6对MWCNTs诱导的Smad2/3蛋白磷酸化的影响。结果:1.MWCNTs理化表征和分散状态:MWCNTs外径8-15 nm,内径3-5nm,长度10-50μm,比表面积140.77 m~2/g,纯度大于98%,所含金属杂质主要是Fe和Ni,分别占0.2%和0.5%。DLS结果显示,在72 h时MWCNTs团聚物的流体动力学直径最大,为356 nm,且此时的聚合物分散性指数(polymer dispersity index,PDI)为0.45。在0-72 h,MWCNTs的流体动力学直径和PDI没有显著变化,说明染毒0-72 h,MWCNTs在分散液中较稳定。2.BEAS-2B细胞对MWCNTs的摄取:用4μg/cm~2的MWCNTs处理BEAS-2B细胞72 h后,TEM观察到MWCNTs进入细胞,且主要以团聚物的形式存在于细胞质的囊泡中。3.MWCNTs对BEAS-2B细胞EMT的影响:用0.25μg/cm~2、1μg/cm~2和4μg/cm~2的MWCNTs处理BEAS-2B细胞72 h后,与对照组相比,上皮标志物E-cadherin在1μg/cm~2和4μg/cm~2浓度组时显著降低(P<0.01)。间质标志物vimentin和α-SMA表达呈现浓度依赖式的升高(P<0.05或P<0.01)。4.MWCNTs对BEAS-2B细胞中SIRT6蛋白表达的影响:用0.25μg/cm~2、1μg/cm~2和4μg/cm~2的MWCNTs处理BEAS-2B细胞72 h后,与对照组相比,SIRT6蛋白表达水平呈升高的趋势,并在4μg/cm~2浓度组时显著升高(P<0.05)。5.过表达或敲低SIRT6对BEAS-2B细胞EMT的影响:过表达SIRT6可以显著减弱MWCNTs诱导的EMT(P<0.05或P<0.01),但是敲低SIRT6对MWCNTs诱导的EMT无作用。6.过表达SIRT6对MWCNTs诱导的EMT相关细胞学行为的影响:过表达SIRT6显著抑制MWCNTs诱导的MMP-2、MMP-9、COL3A1和TGF-β1 mRNA的表达(P<0.01),并显著抑制MMP-2和MMP-9的蛋白表达(P<0.05或P<0.01)。同时MWCNTs诱导的BEAS-2B细胞迁移能力受到抑制(P<0.01)。7.过表达SIRT6对MWCNTs激活的TGF-β1/Smad2通路的作用:4μg/cm~2MWCNTs处理BEAS-2B细胞1 h后Smad2和Smad3蛋白磷酸化水平显著上调(P<0.01)。过表达SIRT6可显著抑制MWCNTs诱导的Smad2蛋白磷酸化水平(P<0.01),但对Smad3的蛋白磷酸化没有作用。无去乙酰化酶活性的突变体SIRT6(H133Y)未能减弱MWCNTs诱导的Smad2的蛋白磷酸化水平。结论:不同浓度MWCNTs处理BEAS-2B细胞72 h,SIRT6蛋白表达水平随染毒浓度升高而逐渐升高。过表达SIRT6削弱了MWCNTs诱导的BEAS-2B细胞EMT。SIRT6通过失活TGF-β1/Smad2信号通路抑制MWCNTs诱导的EMT,且该过程依赖SIRT6的去乙酰化酶活性。