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背景肺癌是全世界最常见的癌症,也是癌症相关死亡的首要原因。近年来,靶向治疗和免疫治疗的出现极大地改变了非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者的预后,但患者的5年生存率仍较低,肺癌的治疗仍然面临着很大的挑战,寻找新的治疗策略和治疗药物对于有效治疗非小细胞肺癌至关重要。细胞凋亡是程序性死亡的一种方式,该过程的失调可导致细胞增殖不受控制、癌症的发生和进展以及对药物治疗的抵抗,对细胞凋亡信号传导机制、参与凋亡的关键蛋白以及癌细胞逃避细胞凋亡的机制进行研究,可以为肺癌的治疗提供新的思路。他汀类药物已被证明可以通过抑制增殖、诱导凋亡等多种机制发挥抗肿瘤作用,是有前景的治疗药物。JAK2/STAT3通路是机体内重要的信号通路之一,研究发现JAK2/STAT3通路在多种肿瘤细胞中可以被组成性激活,参与细胞增殖、侵袭转移、凋亡、血管形成等生理过程,因此,靶向抑制JAK2/STAT3信号通路是一种很有吸引力的抗癌策略。既往研究已经发现辛伐他汀可以诱导肺癌细胞的凋亡,但其作用机制和相关通路尚不清楚。目的探究辛伐他汀对肺腺癌A549细胞凋亡的作用及作用机制。方法1.用不同浓度辛伐他汀处理A549细胞24h、48h后,采用CCK-8法检测对肺腺癌A549细胞存活率的影响,根据结果设置实验中辛伐他汀的作用浓度;2.通过流式细胞术检测辛伐他汀对A549细胞周期的影响;3.通过JC-1荧光探针检测辛伐他汀对线粒体膜电位的影响;4.通过流式Annexin V-FITC/PI双染法检测辛伐他汀对A549细胞凋亡的作用;5.通过Western blot法检测不同浓度辛伐他汀对Bax和Bcl-2蛋白表达的影响;6.通过Western Blot法检测线粒体中Bax、Bcl-2、Cytochrome C蛋白的表达水平,进一步验证线粒体途径在辛伐他汀诱导凋亡过程中的作用;7.CCK-8法检测caspase抑制剂对A549细胞存活率的影响;TUNEL法检测caspase抑制剂对于辛伐他汀诱导的A549细胞凋亡的影响;8.干扰凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor,AIF)表达后,用 Western Blot法检测线粒体和胞质中AIF蛋白的表达水平;9.免疫荧光法检测AIF的入核情况,来探究AIF在辛伐他汀诱导的凋亡过程中的作用;10.使用String数据库对输入蛋白进行蛋白-蛋白相互作用分析(protein-protein interaction,PPI);11.不同浓度辛伐他汀处理A549细胞后,Western Blot法检测JAK2/STAT3通路相关蛋白p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3的表达水平,来探究JAK2/STAT3通路在辛伐他汀诱导的凋亡过程中的作用;先用JAK2/STAT3通路激活剂IL-6预处理细胞后,再用辛伐他汀处理,Western Blot法检测JAK2/STAT3通路相关蛋白 p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3 的表达水平,进一步探究 JAK2/STAT3通路在辛伐他汀诱导的凋亡过程中的作用。结果1.在相同的作用时间下,随着辛伐他汀浓度的升高,细胞的存活率逐渐下降;在相同的作用浓度下,辛伐他汀处理48h后的细胞存活率低于24h组;表明一定浓度和时间范围内,辛伐他汀对于A549细胞生长的抑制作用具有浓度和时间依赖性。20、40、80μg/ml辛伐他汀处理组的细胞存活率低于溶媒对照组(P<0.05);2.细胞周期的检测结果显示,随着辛伐他汀浓度的升高,处于G0/G1期的细胞数所占的比例增加,处于G2/M期的细胞比例减少,20、40μg/ml的辛伐他汀处理组与对照组相比具有统计学差异(P<0.01);3.线粒体膜电位的检测结果显示,与对照组相比,随着辛伐他汀浓度的升高,线粒体膜电位降低(P<0.01);4.流式细胞术结果显示,随着辛伐他汀浓度的升高,细胞的凋亡率增加,20、40μg/ml的辛伐他汀处理组的凋亡率与对照组相比具有统计学差异(P<0.01);5.不同浓度辛伐他汀作用后,随着浓度的升高,凋亡蛋白Bax表达量升高,凋亡抑制蛋白Bcl-2表达降低。与对照组相比,10、20、40μg/ml辛伐他汀处理组Bax蛋白的表达水平升高(P<0.05),20、40μg/ml辛伐他汀组Bcl-2蛋白的表达水平降低(P<0.01);6.Western Blot结果显示,与对照组相比,辛伐他汀处理组线粒体中凋亡蛋白Bax表达量升高(P<0.05),凋亡抑制蛋白Bcl-2和Cytochrome C蛋白表达量降低(P<0.05);7.CCK-8结果显示,与对照组相比,辛伐他汀处理组、辛伐他汀联合caspase抑制剂处理组的细胞存活率均下降,但两者之间的差异无统计学意义(P>0.05);TUNEL结果显示,与对照组相比,辛伐他汀处理组中荧光染色阳性的细胞明显增多,caspase抑制剂和辛伐他汀共同处理细胞后,荧光染色阳性的细胞并没有明显减少;8.Western Blot结果显示,与对照组相比,线粒体中各组AIF蛋白表达量均降低(P<0.01);细胞质中,辛伐他汀处理组AIF蛋白表达量增多,而AIF抑制剂或AIF-siRNA和辛伐他汀共同作用后,AIF蛋白的表达量较辛伐他汀处理组降低(P<0.01);9.通过免疫荧光法进一步研究AIF入核的情况,结果显示,对照组A549细胞AIF阳性荧光主要聚集在细胞质内,与DAPI重叠不明显;辛伐他汀处理组细胞核内AIF荧光与DAPI重叠,并且有入核趋势;10.PPI网络图提示AIF、Bcl-2、Bax、STAT3、JAK2蛋白之间存在相互作用关系;11.不同浓度的辛伐他汀处理A549细胞后,(20、40μg/ml)辛伐他汀处理组细胞内磷酸化的JAK2(p-JAK2)、磷酸化的STAT3(p-STAT3)水平下降,与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。应用JAK2/STAT3通路激活剂IL-6预处理细胞后,p-JAK2和p-STAT3蛋白水平较对照组升高,随着辛伐他汀处理浓度的升高,细胞中IL-6引起的JAK2和STAT3磷酸化水平受到抑制,蛋白表达水平较IL-6处理组降低(P<0.05)。结论1.辛伐他汀能够抑制A549细胞的活性,诱导细胞周期阻滞于G0/G1期,并能诱导A549细胞的凋亡。2.辛伐他汀能激活A549细胞内caspase非依赖性、由AIF介导的线粒体凋亡途径,其作用机制与抑制JAK2/STAT3信号通路相关。