黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)编码的2b蛋白是最早发现的RNA沉默抑制子之一,可以在RNA沉默的不同阶段发挥抑制子功能。2b能够与AGO1和AGO4蛋白互作,抑制它们的切割活性;此外,2b能够结合长的双链RNA和不同长度的siRNA,阻碍RISC复合物的形成以及siRNA的扩增。2b发挥抑制子功能主要依赖于其siRNA结合活性,但在此过程中2b的多聚体结构对2b抑制子功能和病毒致病性的作用仍不是很清楚。本研究以CMV亚组I的Fny株系为研究材料,对2b的多聚体结构在其抑制子功能和病毒致病性方面的重要作用进行了分析。此外,本研究中筛选鉴定了与2b蛋白互作的寄主因子DAYSLEEPER蛋白,并初步研究了该蛋白对2b的抑制子功能和CMV的致病性的影响。实验室前期的工作中发现CMV的2b蛋白N端第15位亮氨酸(L15)和18位甲硫氨酸(M18)是病毒致病性的关键氨基酸,这两个氨基酸的突变减弱了 CMV对野生型拟南芥的致病性,但不影响病毒在rdr6突变体上的症状和积累量。在此基础上本研究首先构建了这两个位点的单突变体病毒CMV-2bl和CMV-2bm,利用单突变体和双突变体病毒接种dcl2、dcl4以及dcl2/dcl4等拟南芥突变体,结果显示突变体病毒在dcl4突变体以及dcl2/dcl4双突变体拟南芥中的积累量明显增加,这说明拟南芥中的DCL4在抵抗突变体病毒CMV-2bl,CMV-2bm和CMV-2blm中起主要作用。培育获得2b和2blm转基因拟南芥,其中2b转基因拟南芥叶片呈锯齿状,植株矮小,后期花期延迟;而2blm转基因植株不具有特殊表型,与空载体转基因及非转基因植株表型相似。缺失2b的突变体病毒CMV-m2b接种2b和2blm转基因拟南芥,结果显示超表达的2b能够恢复CMV-m2b的病毒积累量,而突变体2blm则丧失此功能。在农杆菌瞬时表达GFP诱导局部沉默的系统中,2b蛋白的单突变体2bl、2bm及双突变体2blm抑制GFP局部沉默的能力明显减弱,但与空载体相比还保留部分的抑制能力。与GFP共注射转基因16c本生烟的实验结果证明了突变体2bl、2bm和2blm抑制系统沉默的能力明显下降,说明这两个位点是2b发挥抑制子功能所必需的。为了研究L15和M18对2b蛋白结构和生化性质的影响,原核表达和纯化N端61个氨基酸截短的2b以及突变体蛋白。首先,利用凝胶迁移实验(EMSA)证明2blm结合siRNA的能力明显减弱,但2blm结合长的双链RNA的能力不受影响。体外交联实验证明2b蛋白能够形成二聚体和四聚体,而突变体2blm只能形成二聚体,不能形成四聚体;体内蛋白多聚化实验也证明2b蛋白在体内有单体、二聚体和四聚体的形式,而突变体2blm只有单体和二聚体的形式。以上实验结果表明,CMV的2b蛋白N端15位的亮氨酸和18位的甲硫氨酸是2b蛋白结合siRNA的关键氨基酸,同时也是2b蛋白形成四聚体所必需的,对病毒的致病性和2b的抑制子功能至关重要。这对更好的理解CMV 2b蛋白的多聚体结构在其抑制子功能及病毒致病性中的重要作用提供了有价值的参考。RNA沉默抑制子(VSR)能够干扰宿主的抗病毒RNA沉默,宿主为了抵抗VSR对RNA沉默的抑制,进化产生了能够抑制VSR的内源蛋白因子。本研究中,利用CMV的沉默抑制子2b蛋白筛选拟南芥体内可能与其互作的宿主蛋白。通过双分子荧光互补(BiFC)和免疫共沉淀(Co-IP)的方法,证明拟南芥中转座酶DAYSLEEPER与2b蛋白在植物体内存在相互作用,并且这种互作发生在细胞质和细胞核中。体外pull-down实验进一步证明CMV的2b蛋白可以和DAYSLEEPER发生直接互作。通过对DAYSLEEPER和2b的截短突变体的互作分析,确定DAYSLEEPER的N端包含核定位信号区(NLS)和BED锌指结构区的1-149氨基酸与2b的N端1-61氨基酸区域(即siRNA结合区)发生直接互作。通过农杆菌介导的瞬时表达系统证明DAYSLEEPER与2b的直接互作能够减弱2b的抑制子活性。同时,EMSA实验证明DAYSLEEPER通过负调控2b的siRNA结合活性从而抑制其抑制子功能。DAYSLEEPER在本生烟叶片上的瞬时表达能够影响野生型CMV侵染的复制积累量,而对缺失2b的突变体病毒CMV-m2b没有影响。以上结果表明,拟南芥中的转座酶DAYSLEEPER能够与CMV的2b蛋白siRNA结合区互作,从而负调控2b的siRNA结合活性,并减弱2b抑制子功能,最终影响CMV病毒的致病性,增强植物的抗病力。这些研究结果为病毒和寄主植物进化过程中的长期斗争提供了新证据。