论文部分内容阅读
慢性炎症与肿瘤的发生密切相关，据估计大于15％的恶性肿瘤与慢性炎症有关，这种相关性在消化系统尤为显著，如幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)感染所致的慢性萎缩性胃炎增加胃癌发生的危险性，HBV感染导致的慢性肝炎、肝硬化增加肝细胞癌发生的危险性，以及炎症性肠病相关的结肠癌变等，长期服用NSAIDs可明显降低结肠癌的发生率(降低40-50％)，这从另一侧面说明了炎症与肿瘤之间相关性。胃癌的发生是一个多因素、多步骤的过程。肠型胃癌的发生是一个经历慢性萎缩性胃炎→肠化生→异型增生→早期胃癌→进展期胃癌的多阶段的过程；在此过程中，环境致癌因素如Hp感染，与宿主遗传易感性以及宿主免疫状态共同决定了胃癌的发生与发展。近年来，一类新的CD4+T辅助细胞——Th17细胞，作为一类独特的效应Th细胞亚群被发现，被认为与炎症反应(防御胞外病原菌的感染)、自身免疫性疾病、肿瘤和移植排斥等的发生和发展有关。随着Th17细胞的发现，许多炎症性疾病、自身免疫性疾病的机制研究取得了较大进展。许多既往认为与Th1免疫通路相关的疾病，被发现实际上与Th17通路有关。“IL23-Th17-IL17A/IL17F”轴在炎症反应中所起的作用日趋明显。这个复杂的网络主要以Th17细胞为核心，通过分泌IL17A及IL17F等炎症因子起效应，并受IL23/IL23R、IL6、TGFβ与IL1β等炎症因子调控。“IL23-Th17-IL17A/IL17F”轴还被发现与Hp感染所致胃黏膜炎症相关。在炎症相关肿瘤的发生中，IL23/IL17轴介导的信号传导通路亦可能起着重要作用。鉴于炎症与肿瘤的密切联系，研究这条通路中的炎症因子与胃癌关系无疑对我们探索胃癌的发病机制有着积极的意义。我们从上述细胞因子基因多态性是否影响国人胃癌易感性入手，采用大样本的病例-对照研究，进一步分析这些细胞因子基因多态性对不同组织病理学类型胃癌及其对患者预后的影响。而后者对了解细胞因子基因多态性与胃癌的关系更具现实意义，可以从另一个侧面更深层次来揭示胃癌的发病机制。
本研究组曾研究了Th17细胞通路中对Th17细胞分化起决定作用的IL1B、IL23R以及TGFB、IL6等细胞因子基因多态性与胃癌易感性的关系，作为系列研究的一部分，本研究的目的是：(1)通过大样本的病例-对照研究，对Th17细胞的下游效应细胞因子IL17A、IL17F基因多态性与胃癌的关系进行探讨，并进一步分析各个基因型与胃癌临床病理特征及其预后的关系；(2)在上述研究基础上，通过体外实验探索IL17A及IL17F对胃癌生物学行为的影响及其参与胃癌发病的可能机制，试图从更深一个层面揭示上述细胞因子与胃癌发病的关系。本研究分为两个部分：
第一部分：IL17A、17F基因多态性与胃癌临床病理类型关系的研究。
目的：幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)感染所致的胃粘膜慢性炎症与胃癌的发生密切相关。近年来，一类新的CD4+T辅助细胞—Th17细胞介导的炎症因子通路“IL23→Th17→IL17A/IL17F”被发现与炎症性疾病及自身免疫疾病密切相关，并可能参与炎症相关肿瘤的形成。Th17细胞分泌的关键细胞因子IL17A以及IL17F均为促炎症细胞因子，其基因多态性被发现与多种炎症性疾病密切相关。本研究旨在分析IL17AG197A及IL17FA7488G(p.His161Arg)多态性与本地区胃癌易感性的关系，进一步分析其与胃癌患者临床病理学类型及预后的关系，以期了解Th17细胞通路关键细胞因子基因多态性与胃癌及其与各种不同病理类型胃癌发病的关系。
方法：基因组DNA分别取自1010例手术病理确诊的胃癌患者及800同期健康对照，通过查阅病历资料和电话随访的方式获取患者临床资料及生存资料，采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)进行IL17A197及IL17F7488基因型分型，基因型与胃癌的发病风险因素优势比(OR)及95％的可信区间(Cl)，采用Logistic回归分析；临床病理学特点及基因型的相关性分析采用列联表和Pearsons X2检验；基因多态性与预后的关系采用Log-rank检验及Kaplan-Meier生存曲线分析；多变量生存分析采用Cox回归模型。
结果：IL17FA7488G多态性与胃癌发病风险增加有关。与AA基因型相比，IL17F7488 GA及GG基因型显著增加胃癌发病风险，经性别年龄调整后，OR值分别为1.51(95％ Cl=1.22-1.87，P＜0.001)及1.61(95％ Cl=1.03-2.51，P=0.036)；IL17A G197A多态性与胃癌易感性无关(P=0.098)。进一步与胃癌临床病理类型关联后发现：IL17F7488 GA基因型与非贲门癌(OR=1.51，95％Cl=1.21-1.89，P＜0.001)、肠型(OR=1.55，95％Cl=1.24-1.94，P＜0.001)、低(OR=1.48，95％Cl=1.17-1.88，P=0.001)、中(OR=1.45，95％Cl=1.04-2.04，P=0.031)分化、年龄大于40岁(40～65岁：OR=1.71，95％Cl=1.27-2.3，P＜0.001)；大于等于65岁：OR=1.51，95％Cl=1.27-2.31，P=0.036)、肿瘤体积较大(TⅢ/Ⅳ期)(OR=1.43，95％Cl=1.14-1.80，P=0.002)以及发生淋巴结转移(OR=1.42，95％Cl=1.11-1.83，P=0.006)等胃癌亚型的发病风险增加有关。而IL17A197 AG基因型则增加低分化(OR=1.40，95％Cl=1.06-1.85，P=0.018)、TNMⅠ/Ⅱ期(OR=1.6，95％Cl=1.08-2.36，P=0.020)、年龄40～65岁(OR=1.45，95％Cl=1.05-1.99，P=0.024)胃癌亚型的发病风险。单因素分析以及多因素回归分析均显示，IL17A G197A及IL17F A7488G各种基因型均与胃癌患者预后无关(P＞0.05)。
结论：IL17FA7488G多态性与胃癌易感性有关，IL17F7488 GA基因型显著增加胃癌发病风险，并与非贲门癌、肠型、低中分化等病理学类型有关；IL17AG197A仅与某些胃癌亚型的发病风险增加有关，与整体胃癌易感性无关；二者均不是影响患者预后的独立危险因素。
第二部分：IL17A、17F基因多态性增加胃癌发病风险的可能机制研究。
目的：目前研究认为“IL23→Th17→IL17A/IL17F”轴可能与炎症相关肿瘤的发生有关。我们从临床流行病学证实了IL17F7488 GA及GG基因型增加胃癌发病风险，IL17A197AG基因型与某些亚型胃癌风险增加有关。然而IL17A、IL17F在胃癌发生、发展中的作用尚不得而知。本部分研究中，我们拟进一步了解IL17A蛋白在胃癌组织以及正常胃粘膜组织中的表达情况，并通过体外试验，了解IL17A及IL17F对胃癌生物学行为的影响进而探索其参与胃癌发病的可能机制。
方法：采用免疫组化、RT-PCR的方法，探讨IL17A在人胃癌、正常胃黏膜组织以及胃癌细胞株中的表达情况；采用RT-PCR、Real-time PCR的方法，探讨重组人IL17A、IL17F蛋白体外刺激对胃癌细胞AGS、SGC7901分泌下游因子：IL6、COX-2、VEGF、MMP9、MMP13的影响;采用MTT、划痕试验以及流式细胞技术，探讨重组人IL17A、IL17F蛋白体外刺激对胃癌细胞AGS、SGC7901的生长、侵袭及凋亡的影响。
结果：①免疫组化结果显示，IL17A在胃癌组织以及正常胃黏膜组织中均有表达，在胃癌组织中表达显著高于正常胃黏膜组织(平均秩39.06 vs23.47，Z=-2.693，P=0.007)，IL17A主要表达于肿瘤组织中浸润的炎症细胞以及血管内皮细胞的胞浆。RT-PCR结果显示IL17A以及IL17F mRNA在多种胃癌细胞株中均无表达。②RT-PCR以及Real-time PCR结果均显示：IL17A、IL17F作用于胃癌细胞株AGS、SGC7901，能促进IL6以及MMP13 mRNA表达，Real-timePCR结果示：随着IL17A/17F浓度的增加，IL6以及MMP13 mRNA表达亦明显增加；相同浓度的IL17A作用较IL17F强；RT-PCR结果显示不同浓度IL17A或IL17F作用，对两种细胞表达COX-2、VEGF、MMP9 mRNA无显著影响。③MTT结果显示：IL17A、IL17F蛋白体外刺激胃癌细胞株，能促进细胞增殖，且在作用的24小时内较明显，呈剂量依赖性。IL17A或IL17F作用于划痕的AGS细胞或SGC7901细胞，均能促进其愈合率，愈合率随浓度增加而增加。IL17A、IL17F均能抑制H2O2诱导的AGS、SGC7901细胞的凋亡，但无明显的浓度依赖性。
结论：①IL17A在胃癌组织中表达增加，主要表达于肿瘤组织中浸润的炎症细胞以及血管内皮细胞。②IL17A、IL17F蛋白刺激AGS、SGC7901细胞，呈浓度依赖性地促进IL6、MMP13 mRNA表达，但对COX-2、VEGF、MMP9 mRNA表达无显著影响。③IL17A、IL17F蛋白刺激AGS、SGC7901细胞，可促进细胞增殖、抑制H2O2诱导的细胞凋亡，并增加细胞的迁移能力。