背景:　　 大肠癌是世界范围内最常见的消化系统恶性肿瘤之一,发病率居恶性肿瘤的第3位,严重威胁人类的健康。在我国,大肠癌死亡率已位居恶性肿瘤的第4-5位之间,并呈现增加的趋势。近年来,尽管诊治水平不断提高,但大肠癌总体疗效并无明显改善,术后5年生存率仍徘徊在30％～50％。究其因为,目前在大肠癌早期诊断、预后评估、复发转移防治等方面仍然存在困难。特别是术后转移的发生,已成为患者治疗失败与死亡的重要因为。因此,深入研究大肠癌发病机制,寻找理想的用于早期诊断或预后判断的肿瘤标志物,阐明大肠癌转移分子机制,具有重要的临床意义。　　 研究表明,肿瘤发生是经典遗传学改变与表观遗传异常共同作用的结果。DNA甲基化是表观遗传学中非常重要的基因调控机制,基因广泛低甲基化和区域性高甲基化与大肠癌发生发展密切相关。TIP30是近年新发现的一种与肿瘤转移抑制相关的基因,序列分析显示其与CC3结构相同为同一基因。TIP30在人类的正常组织如心、脑、肾、胰腺等均有表达,而在人类肝癌、肺癌、乳腺癌和前列腺癌中的表达是下调或缺失的。研究表明,TIP30可促进细胞凋亡、抑制肿瘤血管生成,可调节转移相关基因的表达,抑制肿瘤转移。最近,TIP30低表达在大肠癌组织中也得到了验证。但是,TIP30在大肠癌中低表达的因为及其分子调控机制尚未见报道。　　 目的:　　 (1)研究TIP30在大肠癌与配对正常大肠黏膜中的表达差异,以及TIP30基因启动子甲基化在不同组织中的表达状态,分析TIP30启动子甲基化状态与TIP30蛋白表达、TIP30启动子甲基化状态与患者临床病理特征间的关系。(2)研究大肠癌细胞株中TIP30基因启动子甲基化状态和TIP30 mRNA和蛋白表达水平,进一步探讨启动子甲基化对TIP30 mRNA和蛋白表达的影响。(3)研究重建TIP30表达对大肠癌细胞体外、体内生物学特性的影响,探讨TIP30用于大肠癌基因治疗的可能性。　　 方法：　　 1.采用甲基化特异性PCR(MSP)、甲基化测序PCR(BSP)方法检测50例大肠癌和配对正常大肠黏膜组织中TIP30基因启动子甲基化状态,采用免疫组化法检测TIP30蛋白表达水平。分析大肠癌标本中TIP30基因启动子甲基化与TIP30蛋白表达水平是否存在相关性；分析TIP30基因启动子甲基化状态与患者临床病理特征(包括患者性别、病变部位、临床分期、血清CEA水平、淋巴结转移等)的相关性。　　 2.采用BSP、MSP方法检测大肠癌细胞株(HCT116和HT29)中TIP30基因启动子甲基化状态,采用RT-PCR法、Western blot法检测大肠癌细胞株中TIP30mRNA和蛋白表达水平。观察加入去甲基化药物5-aza-2-deoxycytidine(DAC)后,存在TIP30基因启动子高甲基化的大肠癌细胞株TIP30 mRNA和蛋白表达是否上调。分析TIP30表达变化与TIP30基因启动子甲基化状态的关系。　　 3.PCR克隆人TIP30基因,连接到pMD18-T-simple质粒上,转化大肠杆菌DH5α,经Amp抗性、质粒DNA抽提、酶切鉴定筛选得到阳性克隆,测序。用EcoRI和BamHI限制性核酸内切酶切割测序正确的质粒pMD18-T-simple-TIP30与pCMV4-flag,所得产物连接形成真核表达载体pCMV4-flag-TIP30。用脂质体介导转染法,将构建的真核表达载体pCMV4-flag-TIP30导入培养的TIP30表达缺失的HCT116中,同时转染空质粒pCMV4-flag作对照。经G418筛选,获得阳性克隆细胞。用RT-PCR和Western blot方法,检测转染真核表达载体细胞(HCT116-TIP30)、转染空载体细胞(HCT116-control)和亲本细胞(HCT116)中TIP30 mRNA和蛋白表达。　　 4.体外观察上述3组细胞生长速度并绘制生长曲线；流式细胞仪检测3组细胞凋亡率；划痕实验检测TIP30对HCT116细胞迁移能力的影响；软琼脂克隆形成实验检测TIP30对HCT116细胞锚定非依赖性生长的影响；体外Matrigel侵袭实验检测TIP30对HCT116细胞侵袭能力的影响。分别用3×106个HCT116-TIP30细胞与HCT116-control细胞接种6周龄大的Balb/c裸鼠,每组10只,观察成瘤情况并测量肿瘤体积。　　 结果：　　 1.免疫组化结果显示在50例大肠癌和配对正常大肠组织中,TIP30蛋白表达缺失分别为20例(40％)和5例(10％),两者相比差异有统计学意义(P<0.05)。MSP结果显示在50例正常大肠黏膜组织中未见TIP30启动子高甲基化,而在50例大肠癌患者中有18例(36％)TIP30启动子为高甲基化。BSP测序验证MSP的实验结果,两种方法结果基本一致。在18例TIP30启动子高甲基化的患者中有12例(66.7％)TIP30蛋白表达缺失,在32例TIP30启动子未甲基化的患者中有8例(25％)TIP30蛋白表达缺失,两者相比差异有统计学意义(P<0.05)。分析TIP30启动子甲基化状态与患者临床病理指标的相关性发现,大肠癌TIP30启动子高甲基化与患者淋巴结转移情况(P=0.003)、CEA水平(P＝0.005)及临床分期(P=0.048)之间存在显著相关性,与病变部位(结肠与直肠)之间未见显著相关性(P=0.309)。此外,TIP30启动子高甲基化在血清CEA水平较高(>15 ng/ml)的患者中比血清CEA水平较低(<15ng/ml)的患者中更常见(P=0.005),提示TIP30启动子高甲基化可能作为大肠癌的肿瘤标志物。　　 2.细胞株水平研究结果显示,未加入去甲基化药物DAC时,TIP30启动子在人大肠癌细胞株HCT116中处在高甲基化状态,而在人大肠癌细胞株HT29中则无高甲基化状态存在;HCT116中TIP30 mRNA和蛋白均未见表达,而HT29中TIP30mRNA和蛋白均有表达。加入DAC后,HCT116中TIP30 mRNA和蛋白表达恢复,而HT29中TIP30 mRNA和蛋白表达明显上调。DAC可逆转并恢复上述大肠癌细胞株TIP30 mRNA和蛋白表达水平。大肠癌细胞株中TIP30基因启动子甲基化状态和TIP30 mRNA和蛋白表达水平呈负相关。　　 3.成功构建真核表达质粒pCMV4-flag-TIP30,G418筛选出稳定表达TIP30的大肠癌细胞株HCT116-TIP30,同时筛选出不表达TIP30的HCT116-control作为实验对照,RT-PCR租Western blot验证了TIP30 mRNA和蛋白在HCT116-TIP30中正确表达,而在HCT116-control和HCT116中表达缺失。　　 4.对比上述3组细胞生长速度,HCT116-TIP30细胞生长明显比HCT116-control和HCT116细胞慢,差别具有统计学意义(P<0.001),而HCT116-control和HCT116细胞之间无统计学差异。流式细胞仪检测发现HCT116-TIP30细胞自然凋亡率较高(18.9±3.5％),与HCT116细胞(3.3±1.1％)和HCT116-control细胞(3.7±1.4％)差别均有统计学意义(P<0.001),而HCT116-control和HCT116细胞之间无统计学差异。划痕实验显示,TIP30的再表达造成HCT116细胞迁移力的减低。软琼脂克隆形成实验显示,TIP30抑制了HCT116细胞锚定非依赖性生长。体外Matrigel侵袭实验显示,TIP30抑制了HCT116细胞的侵袭能力。裸鼠成瘤实验显示,HCT116-TIP30与HCT116-control细胞注射到裸鼠皮下28天,HCT116-control细胞在14天时已长出瘤块,而HCT116-TIP30细胞28天后仍未能长出瘤块。　　 结论：　　 1人大肠癌组织中抑癌基因TIP30的表达下降与其启动子的高甲基化有关。TIP30启动子甲基化在大肠癌组织里普遍存在,而在正常大肠黏膜组织中则很少出现。TIP30启动子高甲基化与大肠癌淋巴结转移、CEA水平及临床分期呈正相关,与病变部位无明显相关性。TIP30启动子甲基化有望成为一种新的大肠癌分子诊断肿瘤标志物。　　 2大肠癌细胞株中TIP30再表达不但能抑制细胞生长、诱导细胞凋亡,而且能抑制细胞锚定非依赖生长、降低细胞迁移力和侵袭力。本研究表明大肠癌中TIP30基因是一种肿瘤转移抑制基因,为TIP30在大肠癌基因治疗中的应用提供了实验依据。