背景:胆汁淤积性肝病发病率高,主要表现为胆汁酸代谢紊乱、胆汁酸蓄积及肝损伤,若未能有效干预,最终将演变成肝纤维化和肝硬化。熊去氧胆酸（Ursodesoxycholic acid,UDCA）和奥贝胆酸等治疗药物临床疗效有限。因此,进一步研究胆汁酸代谢转运调控机制,寻找新的治疗策略显得尤为重要。法尼醇X受体（Farnesol X receptor,FXR）和核因子E2相关因子2（Nuclear factor red related factor 2,NRF2）是调控胆汁酸代谢转运的两个重要因子,是治疗胆汁淤积性肝损伤的重要靶点。现有抗胆汁淤积药理研究往往只涉及其中的单个调控因子或单个作用靶点,对FXR和NRF2双信号通路的交互作用及共同调控关注甚少。齐墩果酸（Oleanolic acid,OA）广泛存在于山楂等传统中草药中,具有保肝护肝等生物活性。有学者使用胆管结扎、胆石酸等造模,分别从NRF2及FXR信号通路着手,研究表明OA有较好的抗胆汁淤积作用。而α-萘酚异硫氰酸酯（Alpha-naphthylisothiocyanate,ANIT）所致啮齿动物胆汁淤积模型的胆道特征与人类原发性胆汁性胆管炎的病理特征更相似。因此,使用ANIT造模来研究OA的抗胆汁淤积作用显得非常必要。那么OA是否同时通过NRF2和FXR双信号通路来共同调节胆汁酸代谢,进而缓解ANIT所致的胆汁淤积性肝损伤?目前仍不清楚,有待明确与探索。另有研究提示,炎症状态下β-catenin参与了胆汁淤积的进程,通过抑制β-catenin可激活FXR进而减轻肝脏内胆汁酸淤积。敲除β-catenin可促进NRF2激活进而减轻肝脏氧化应激损伤。此外,有研究表明P300可能参与NRF2和FXR的核内调控。据此我们推测,在OA激活NRF2和FXR双信号通路的过程中,信号通路之间可能通过β-catenin/P300进行交互对话,进而协同调控下游胆汁酸相关靶基因的表达。目的:本课题通过ANIT构建胆汁淤积性肝损伤模型,采用胆汁酸靶向代谢组学、基因敲除或沉默、免疫共沉淀等技术手段,聚焦NRF2和FXR双信号通路的共同调控及其交互作用,深入研究OA对ANIT所致胆汁淤积性肝损伤的保护作用及其机制,为临床上胆汁淤积症的多靶点联合治疗及多靶点药物开发提供理论基础及科学依据。方法:1、OA对大鼠胆汁淤积性肝损伤的保护作用研究以正常Sprague Dawley（SD）大鼠为研究对象,分为正常对照组、OA（100mg/kg）组、ANIT模型组、UDCA（60 mg/kg）+ANIT组、OA低、中、高剂量（25、50、100 mg/kg）+ANIT组和UDCA+OA（100 mg/kg）+ANIT组,连续灌胃给药7 d,处死前48 h灌胃ANIT（60 mg/kg）造模,测定大鼠ALT、AST、ALP、TBIL、γ-GT、TBA、GSH和SOD等生化指标,采用HE染色观察肝组织病理学变化,采用靶向代谢组学技术分析胆汁酸变化情况,采用RT-q PCR和western blot技术测定肝组织中Nrf2、Fxr及其下游Bsep、Ntcp、Cyp7a1和Ugt1a1基因表达情况,采用免疫组织化学方法检测肝组织中BSEP、NTCP、CYP7A1和UGT1A1的蛋白表达。2、OA对大鼠原代肝细胞的保护作用及其对NRF2和FXR双信号通路的影响两步原位灌流法分离获得大鼠原代肝细胞,采用RNA干扰技术沉默细胞Nrf2或Fxr基因,使用ANIT及OA干预,测定大鼠原代肝细胞活性,及其ALT、AST、LDH、GSH和SOD等生化指标,采用RT-q PCR和western blot技术测定原代大鼠肝细胞中Nrf2、Fxr、Bsep、Ntcp、Cyp7a1和Ugt1a1的基因表达。3、OA对Nrf2基因敲除（Nrf2-/-）大鼠和Fxr基因沉默（Fxr-kd）大鼠胆汁淤积性肝损伤的保护作用研究分别以Nrf2-/-大鼠和Fxr-kd大鼠为研究对象,各分为正常对照组、ANIT模型组和OA（100 mg/kg）+ANIT组,连续灌胃给药7 d,处死前48 h灌胃ANIT（60 mg/kg）造模,测定大鼠ALT、AST、ALP、TBIL、γ-GT、TBA、GSH和SOD等生化指标,采用HE染色观察肝组织病理学变化,采用靶向代谢组学技术分析胆汁酸变化情况,采用RT-q PCR和western blot技术测定肝组织中Fxr和Nrf2及其下游Bsep、Ntcp、Cyp7a1和Ugt1a1基因表达情况,采用免疫组织化学方法检测肝组织中BSEP、NTCP、CYP7A1和UGT1A1的蛋白表达。4、OA对L02细胞的保护作用及其对NRF2和FXR双信号通路的影响采用RNA干扰技术沉默细胞NRF2或FXR基因,使用ANIT及OA干预,测定L02细胞活性,及其ALT、AST和LDH等生化指标,采用RT-q PCR和western blot技术测定L02细胞中NRF2、FXR、BSEP、NTCP、CYP7A1和UGT1A1的基因表达。5、Nrf2、FXR信号通路与OA的分子对接及其交互作用研究采用计算机分子对接技术,评价KEAP1（NRF2抑制蛋白）、FXR蛋白与OA之间的相互作用。采用RNA干扰技术沉默细胞NRF2或FXR基因,采用蛋白质免疫共沉淀方法,研究OA对NRF2与KEAP1、FXR与RXRα结合的影响,考察萝卜硫素（Sulforaphane,SFN）和GW4064对细胞中NRF2与P300、P300与β-catenin、β-catenin与FXR、FXR与RXRα结合的影响。结果:1、OA对大鼠胆汁淤积性肝损伤的保护作用研究（1）OA可剂依赖性地逆转ANIT引起的大鼠血清ALT、AST、ALP、TBIL、γ-GT和TBA的升高,增加肝组织的GSH和SOD。（2）OA可剂量依赖性地缓解ANIT所致大鼠肝脏的出血、坏死及炎症浸润情况,且OA高剂量干预后肝组织的出血、坏死及汇管区炎症浸润几乎消失。（3）PCA图和热图结果分别显示OA高剂量干预前后大鼠血清、肝脏和粪便的胆汁酸评分散点完全分开以及胆汁酸组分丰度差异显著,OA高剂量干预可促进ANIT损伤大鼠胆汁酸代谢转运,降低血清及肝脏中的胆汁酸,而增加粪便胆汁酸的含量。（4）OA高剂量干预显著提高ANIT损伤大鼠肝组织中Bsep、Ntcp、Ugt1a1的mRNA和蛋白表达,降低Cyp7a1的基因水平,显著增加Fxr mRNA和蛋白表达水平,促进NRF2入核和Nrf2mRNA的表达。（5）与UDCA+ANIT组比较,联合使用OA可使胆汁淤积性肝损伤大鼠血清ALT和AST降低更显著,肝脏GSH和NRF2核积累显著增加。2、OA对大鼠原代肝细胞的保护作用及其对NRF2和FXR双信号通路的影响（1）与正常对照组比较,OA显著上调原代肝细胞Nrf2和Fxr的基因水平,提高Bsep和Ugt1a1的mRNA和蛋白水平,降低Cyp7a1基因表达,几乎不影响Ntcp基因表达。（2）与ANIT模型组比较,OA干预显著提高原代肝细胞活性、GSH和SOD,降低细胞上清液的ALT、AST和LDH。（3）与ANIT模型组比较,OA干预显著降低Cyp7a1的基因表达,逆转了肝细胞Bsep、Ntcp、Ugt1a1 mRNA和蛋白水平的降低,显著上调Fxr的基因水平,并增加胞核NRF2蛋白表达。（4）Nrf2或Fxr基因沉默后显著减弱了OA对ANIT损伤肝细胞的保护作用及其对下游靶基因的调控作用,其中Nrf2基因沉默后对OA的影响更明显。3、OA分别对Nrf2-/-大鼠和Fxr-kd大鼠胆汁淤积性肝损伤的保护作用研究（1）ANIT灌胃可分别引起Nrf2-/-大鼠和Fxr-kd大鼠血清的ALT、AST、ALP、TBIL、γ-GT和TBA显著升高,并分别引起肝脏的GSH和SOD显著降低,肝组织出现大面积的出血、坏死和炎症浸润情况。（2）与ANIT模型组比较,OA+ANIT组Nrf2-/-大鼠血清中ALT、AST和ALP显著降低,TBIL、γ-GT和TBA无显著改变,肝脏GSH和SOD显著增加,肝组织中出血和坏死区域有所减小,但汇管区仍有大量炎症浸润;与ANIT模型组比较,OA+ANIT组Fxr-kd大鼠血清中ALT、AST、ALP、TBIL、γ-GT和TBA显著降低,肝脏GSH和SOD显著升高,肝组织未见明显的出血和坏死区域,汇管区炎症浸润面积减小。（3）与ANIT模型组比较,OA干预未能显著影响Nrf2-/-大鼠血清、肝脏和粪便中各胆汁酸含量;与ANIT模型组比较,OA干预可促进Fxr-kd大鼠胆汁酸代谢转运,降低血清及肝脏中的胆汁酸,增加粪便胆汁酸的含量,但仍有部分胆汁酸丰度未发生显著变化。（4）与ANIT模型组比较,OA干预可显著提高Nrf2-/-大鼠肝脏Fxr和Bsep的mRNA和蛋白水平,显著减低Cyp7a1的mRNA和蛋白水平,而不能显著影响NTCP和UGT1A1蛋白水平;与ANIT模型组比较,OA干预可显著提高Fxr-kd大鼠肝脏Nrf2、Fxr、Besp和Ugt1a1 mRNA水平,显著降低Cyp7a1的mRNA和蛋白水平,促进NRF2的核内累积及FXR、BSEP、UGT1A1的蛋白表达。（5）与正常SD大鼠,即野生型（wide type,WT）大鼠实验比较,OA干预对ANIT损伤Nrf2-/-大鼠的生化指标及肝脏病理组织的改善作用明显减弱,对胆汁酸代谢组学的改变无明显影响,对胆汁酸代谢转运蛋白表达的影响明显减弱;与WT大鼠实验比较,OA对ANIT损伤Fxr-kd大鼠的肝脏病理组织的改善作用有所减弱,对胆汁酸代谢组学改变未能完全逆转,对胆汁酸代谢转运蛋白表达的影响相对减弱。4、OA对L02细胞的保护作用及其对NRF2和FXR双信号通路的影响（1）与正常对照组比较,OA可上调细胞中NRF2和FXR的基因水平,并提高BSEP和UGT1A1的mRNA和蛋白水平,降低CYP7A1基因表达。（2）与ANIT模型组比较,OA干预显著提高细胞的活性,降低细胞上清液的ALT、AST和LDH,显著下调细胞中CYP7A1基因的表达,逆转BSEP、NTCP、UGT1A1 mRNA和蛋白水平的降低,显著上调FXR基因水平,并增加胞核中NRF2蛋白水平。（3）NRF2或FXR基因沉默显著降低了OA对ANIT损伤细胞的保护作用及其对下游靶基因的调控作用,其中NRF2基因沉默后对OA的影响更明显。5、Nrf2、FXR信号通路与OA的分子对接及其交互作用研究（1）KEAP1与OA的分子对接评分为-8.3 kcal·mol-1,表明KEAP1与OA空间结合力强;FXR与OA的分子对接评分为-6.9 kcal·mol-1,表明FXR与OA空间有结合。（2）OA可显著降低L02细胞NRF2与KEAP1的结合,而增加FXR与RXRα结合。（3）ANIT致L02肝细胞损伤模型中,NRF2与P300结合减少,β-catenin与P300、β-catenin与FXR的结合均显著增加,FXR与RXRα结合减少。（4）SFN和GW4064均可促进NRF2与P300的结合,降低β-catenin与P300、β-catenin与FXR的结合。结论:1、在ANIT所致的大鼠胆汁淤积性肝损伤模型中,OA可显著减少胆汁酸的合成,促进胆汁酸的代谢和流动,显著改变大鼠胆汁酸代谢组学特征,改善损伤大鼠的胆汁酸稳态,显著缓解ANIT所致的胆汁淤积性肝损伤。敲除Nrf2基因后,OA对ANIT损伤大鼠的胆汁酸调控及其抗肝损伤作用显著减弱。沉默Fxr基因后,OA对ANIT损伤大鼠的胆汁酸调控作用减弱,但仍可显著缓解Fxr-kd大鼠胆汁淤积性肝损伤。OA的抗大鼠ANIT损伤作用与其激活NRF2和FXR双信号进而调控胆汁酸代谢转运相关基因的表达有关,其中NRF2信号通路占据更主要地位。2、在ANIT损伤的大鼠原代肝细胞及L02细胞中,OA可显著改善细胞损伤,并通过激活NRF2和FXR双信号通路来调控胆汁酸代谢转运相关基因表达。在沉默大鼠原代肝细胞Nrf2或Fxr基因后,在沉默L02细胞NRF2或FXR基因后,OA对胆汁酸代谢转运相关基因的调节作用均显著减弱,其中沉默Nrf2/NRF2基因后OA作用减弱更显著。在细胞水平,OA的抗ANIT损伤作用与激活NRF2和FXR双信号通路密切相关,其中NRF2信号通路占据更主要地位。3、KEAP1、FXR与OA之间可发生相互作用,提示了OA激活NRF2和FXR双信号通路并发挥抗胆汁淤积作用的分子结构基础。NRF2和FXR双信号通路在激活过程中,二者之间存在基于β-catenin/P300介导的交互作用机制。